基于脂质组学的沙棘油及其掺假油的甘油酯组成比较分析

张九凯，徐冰冰，，韩建勋，邢冉冉，赵 燕，王 玮，陈 颖*

（1 中国检验检疫科学研究院 北京100176 2 南京农业大学食品科技学院 南京210095 3 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 北京100081）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）为胡颓子科（Elaeagnaceae）沙棘属（HippophaeL.）多年生小乔木或落叶灌木，又名酸刺、醋柳果或黑棘等[1-3]。在藏药中应用已有2 000 多年的历史，在1977年作为药食同源物质，被列入《中华人民共和国药典》[4-5]。沙棘在亚欧洲等均有广泛分布，中国是世界上天然沙棘种质资源及人工种植沙棘面积最多的国家，至2018年，中国沙棘总面积达215 万公顷，约占世界总面积的93%[6]。

沙棘油是采用精选的优质沙棘果实或种子为原料，经压榨分离、压滤或采用全精炼、超临界CO2萃取等系列工艺加工而成的棕红色清澈透明植物油，具有沙棘所特有的芳香气味[7]。沙棘油中含有206 种对人体有益的活性物质，包括维生素E、维生素A 和异鼠李素及其糖甙、槲皮素、山柰酚等[8-9]，具有止咳平喘，降低胆固醇水平，提高机体免疫力等功效及对抗化学肝损伤、抑制血小板凝集等作用[10-12]。Yang 等[13]和管文轲等[14]研究发现，沙棘中沙棘籽含油量约为10%，沙棘果含油量约为1.4%～13.7%。仅2016年全球沙棘油年缺口便超过1 200 t，加之沙棘油生产困难、成本高，且中国企业及产品品牌众多，造成沙棘油出现掺假、售假现象，为检测、预防沙棘油掺假现象，保持沙棘油优良品质，保障人们的身心健康，亟需能够有效区分沙棘油及掺假油的检测方法。

食用油是由多种化合物形成的复杂混合物，其主要成分为甘油酯，包括甘油三酯、甘油二酯等，另外，还含有黄酮、维生素、植物甾醇、微量元素和α-生育酚等100 多种小分子生物活性代谢物。通过对甘油三酯等成分进行定性和定量分析，可对各种食用油及掺假油进行区分鉴定[15]。脂质组学是代谢组学的重要分支，2003年由Han 等[16]首次提出并广泛应用于食品脂质的研究，在食品成分分析[17-18]、品质判别[19-20]、真伪鉴别[21-22]和产地溯源[17，23-24]等方面均有运用，其分离及检测技术多样，主要包括气-质谱联用（GC-MS）技术及液质联用（LC-MS）技术等，通过不同分析方法联用，可有效克服单一分析技术的局限性[25-26]。超高效液相色谱串联质谱技术的发展极大地促进了脂质组学的发展[27-28]，超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）技术具有高分辨率及高通量的特点，结合化学计量学分析方法，可实现对食用油中酯类物质的精确定性、定量。Wei 等[29]运用UPLC-QTOF-MS 技术对18 种食用油中的甘油三酯指纹图谱进行检测，证明此方法切实可行，然而并未对沙棘油进行研究。本文基于UPLC-QTOFMS 的脂质组学方法对沙棘油及其掺假油进行鉴别，以减少沙棘油掺假、售假行为的发生，确保沙棘油品质及消费者权益，为沙棘油真实属性鉴别研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

样品收集于国内外各食用油企业，经相关机构认定及试验验证其真实属性，包括20 种沙棘油、16 种葵花籽油、16 种菜籽油及16 种大豆油，涵盖了不同加工等级及加工方式。采用拼音大写首字母样对样品进行命名，例SJY（沙棘油）、KHZY（葵花籽油）、CZY（菜籽油）、DDY（大豆油），详细信息见表1。

表1 沙棘油、葵花籽油、菜籽油和大豆油样品信息Table 1 The sample information of sea buckthorn oil，sunflower seed oil，rapeseed oil and soybean oil

甲醇（色谱级）、水（色谱级）、异丙醇（色谱级），美国Honeywell 公司；乙腈（色谱级），美国Fisher 公司；乙酸铵（色谱级），美国Sigma 公司。

（续表1）

1.2 仪器与设备

100 μL、1 000 μL、5 000 μL 移液器，德国Eppendorf 公司；SA 300 振荡器，北京华威中仪科技有限公司；ME403E 分析天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；KQ-205B 超声波清洗仪，江苏超声仪器有限公司；涡旋振荡器，美国Scientific Industries 公司；LC-20XR 超高效液相色谱系统、TripleTOF 6600 型质谱仪，美国AB SCIEX 公司；Millex-GP 0.22 μm 聚四氯乙烯膜过滤器，北京博尔金科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理 分别精确称取0.1 mg 沙棘油（n=20）、葵花籽油（n=16）、菜籽油（n=16）、大豆油（n=16）于15 mL 离心管中，加入10 mL 超声10 min 的甲醇-异丙醇（V甲醇∶V异丙醇=1∶1，并加入5 mmol/L 乙酸铵）溶液进行溶解、稀释，经孔径为0.22 μm 的聚四氯乙烯膜过滤器过滤至棕色质谱小瓶中，并进行标记。

随机选择沙棘油（n=2，SJY6、SJY19）、葵花籽油（n=2，KHZY6、KHZY14）、菜籽油（n=2，CZY3、CZY8）、大豆油（n=2，DDY2、DDY8）以不同质量比（0%，1%，5%，10%，20%，40%，80%，100%）进行混掺，作为掺假样品；吸取等量纯油样品混合均匀记为QC（QC 为质控样品），可监测仪器的稳定及重复性，并优化色谱条件，掺假样品及QC 处理方法同上述纯油；空白为甲醇-异丙醇（V甲醇∶V异丙醇=1∶1，加入5 mmol/L 乙酸铵）溶液，样品制备完成后放于4 ℃避光冷藏，供分析检测。

1.3.2 脂质分离及检测 采用四级杆飞行时间串联质谱结合配备ExionLC 控制器、ExionLC AD 柱温箱、ExionLC AD 自动进样器及2 个ExionLC AD 泵的超高效液相色谱对沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油中的甘油酯进行分离检测。

高效液相色谱采用美国Phenomenex 公司Kinetex C18 反相色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，100 A），柱温40 ℃；流动相A 为含有5 mmol/L 乙酸铵的甲醇-乙腈-水（体积比1∶1∶3）溶液，流动相B 为含有5 mmol/L 乙酸铵的异丙醇溶液，均超声10 min。梯度洗脱比例设置为：0.0～1.0 min，20% B 相；1.0～3.0 min，20%～70% B 相；3.0～13.0 min，70%～98% B 相；13.0～15.0 min，98% B 相；15.0～15.1 min，98%～20% B 相；15.1～18.0 min，20% B 相。流速0.3 mL/min，进样量1 μL。

应用配备DuoSpray 离子源的四级杆飞行时间串联质谱（TripleTOF 6600，SCIEX），在正离子模式下对样品进行检测，由Analyst TF（Ver1.7.1 AB Sciex 公司）软件进行数据采集。数据采集包括full-scan TOF MS 及MS/MS 两种模式，单针注射进行信息采集时建立动态背景扣除（DBS）、信息依赖采集（IDA）及实时多重质量亏损（MMDF），以期减少杂质等对试验准确性的影响，提高试验数据的可靠性。DuoSpray 离子源采用最佳参数：设置雾化气（GS1）、辅助加热气（GS2）及气帘气分别为345 kPa、379 kPa、207 kPa；离子源温度550 ℃；正离子模式喷雾电压（ISVF）5 500 V；去簇电压（DP）80 V；碰撞能量（CE）和扩展碰撞能量（CES）分别为35 eV 和15 eV。TOF MS 模式下滞留时间250 ms，质量扫描范围为200～1 200m/z；二级MS/MS模式下滞留时间50 ms，质量扫描范围为50～1 200m/z。为保持采集数据的准确度，应用自动校正装置系统（CDS）每隔5 个样品校正一次。

1.3.3 脂质鉴定及统计分析 食用油是以甘油三酯为主要成分（含量可达95%以上），以少量甘油二酯、游离脂肪酸、磷脂类等为次要成分的酯类混合物[30]，甘油三酯是由1 个甘油分子及3 个相同或不相同的脂肪酸分子经脱水酯化而成[31]，具有一定的立体结构。由C18 色谱柱基于等价碳数（Equivalent carbon number，ECN）对甘油酯进行分离，等价碳数（ECN）=脂肪酰基总碳数（Carbon number，CN）-2 倍双键数（Number of double bonds，DB），ECN 常用于描述甘油三酯的色谱属性并预测其洗脱顺序，甘油三酯ECN 越大，表明其保留时间越长，出峰顺序越靠后。

课题组前期试验结果表明正离子模式比负离子模式具有更高的响应强度，可检测更多的离子数目，故本研究选用正离子模式进行检测。正离子模式下离子的加合方式主要包括3 种：[M+NH4]+、[M+Na]+和[M+H]+，其中[M+NH4]+是最为常见的加合离子，因此本试验应用UPLC-QTOF-MS 技术，采用full-scan TOF-MS 及MS/MS 模式对一级质谱母离子及二级质谱碎片离子信息进行扫描，将加合离子为[M+NH4]+的数据导入PeakView（Ver2.2 AB Sciex 公司）软件的MasterView 插件中，结合脂质组学数据库（AB Sciex 公司提供），对沙棘油和其对照油中甘油酯进行定性分析，根据表2[32]计算中性丢失质量，并进行记录。将所鉴定得的各甘油酯名称、分子式及离子加合方式再次导入MasterView，利用其自动计算、匹配一级精确质量数、质荷比、保留时间及丰度的功能，结合考虑同位素类型的误差情况，建立适用于沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油的脂质组学数据库。质量误差范围及保留时间分别设置为0.02 u 及0.4 min。

表2 [M+NH4]+离子加合方式甘油酯酰基链中性质量丢失Table 2 The neutrally loses mass of glycerides acyl of[M+NH4]+ ion addition mode

将经MasterView 处理所得的沙棘油和其对照油的甘油酯峰面积进行归一化处理。应用SIMCA【Ver15 MKS Data Analytics Solutions（原瑞典Umetrics 公司）】软件进行化学计量学分析，即主成分分析（Principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）分析，利用MeV（Multiple experiment viewer，Ver4.9.0）（基于Java 应用程序设计的微阵列数据识别的基因表达模式及差异表达基因分析软件）软件绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 沙棘油及其对照油甘油酯定性分析

UPLC-QTOF-MS 技术具有高通量、高灵敏的特点，在正离子模式下，对沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油信息进行检测，将所得数据采用PeakView 进行分析，获得如图1所示的样品基峰图（Base peak chromatogram，BPC）。

图1 沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油正离子模式基峰图Fig.1 Base peak chromatogram of positive ion mode of sea buckthorn oil，sunflower seed oil，rapeseed oil and soybean oil

样品基峰图是选择每张质谱图中强度最大的离子连续描绘得到的图谱。由图1 可知，沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油之间峰形和出峰时间存在极大差异，这体现了各食用油之间离子的强度规律，出峰形态、数量及时间变化，表明采用化学计量学方法对食用油脂中的甘油脂类进行分析是可靠、可行的。

2.2 沙棘油及其对照油甘油酯鉴定结果

应用基于UPLC-QTOF-MS 的脂质组学技术，对沙棘油及其对照油（葵花籽油、菜籽油和大豆油）在单针注射动态背景扣除（DBS）、实时多重质量亏损（MMDF）及信息依赖采集（IDA）模式下进行检测，将经过Analyst TF 1.7.1 软件导出的数据导入PeakView（Ver2.2），设置Formula Finder 条件为C（n≤80），H（n≤200），O（n≤40），N（n≤40），P（n≤10），Cl（n≤10）和S（n≤10），ppm<5，结合AB Sciex 所提供的脂质组学数据库，根据所得二级图谱，依据中性丢失质量进行计算，并记录质荷比、保留时间、离子加和方式、甘油酯种类及特征化合物化学方程式等。将具有相同ECN 及相同分子质量的甘油酯作为相同酯类，共检出甘油二酯及甘油三酯92 种（表3），其中，甘油二酯16种，甘油三酯76 种。

表3 沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油样品中甘油三酯及甘油二酯组成Table 3 Triacylglycerols and diacylglycerols composition in the sea buckthorn oil，sunflower seed oil，rapeseed oil and soybean oil samples

甘油酯由甘油及脂肪酸组成。沙棘油中甘油酯所含的饱和脂肪酸酰基链有：C8∶0，C12∶0，C14∶0，C16∶0，C18∶0，C20∶0，C22∶0 及C24∶0，单不饱和脂肪酸有C16∶1，C18∶1 及C20∶1，多不饱和脂肪酸有C18∶2 及C18∶3；葵花籽油中饱和脂肪酸有：C8∶0，C12∶0，C14∶0，C16∶0，C18∶0，C20∶0，C22∶0，C24∶0 及C26∶0，单不饱和脂肪酸有C16∶1，C18∶1，C20∶1 及C24∶1，多不饱和脂肪酸有C16∶2，C18∶2 及C18∶3；菜籽油中饱和脂肪有：C2∶0，C8∶0，C10∶0，C12∶0，C14∶0，C16∶0，C20∶0，C22∶0 及C24∶0，单不饱和脂肪酸有C14∶1，C16∶1，C18∶1，C20∶1，C22∶1，C24∶1 及C26∶1，多不饱和脂肪酸有C14∶2，C16∶2，C16∶3，C18∶2，C18∶3 及C20∶2；大豆油中饱和脂肪酸有：C2∶0，C8∶0，C12∶0，C14∶0，C16∶0，C18∶0，C20∶0，C22∶0 及C24∶0，单不饱和脂肪酸有C18∶1，C20∶1及C26∶1，多不饱和脂肪酸有C18∶2，C18∶3 及C20∶2。共24 种脂肪酸，其中饱和脂肪酸有11 种，单不饱和脂肪酸有7 种，多不饱和脂肪酸有6 种，共同组成92 种甘油酯，表明甘油酯较脂肪酸种类更加丰富。

沙棘油和其对照油ECN 范围为24～62，甘油二酯脂肪酰基总碳数为32～42，甘油三酯脂肪酰基总碳数为36～66，甘油二酯双键数范围为1～6，甘油三酯双键数范围为0～9。甘油酯种类因食用油种类的不同而不同，葵花籽油共检测出7 种甘油二酯，36 种甘油三酯；菜籽油中甘油二酯14种，甘油三酯62 种；大豆油中甘油二酯8 种，甘油三酯42 种，而沙棘油共检测到10 种甘油二酯，48种甘油三酯。由此，通过对比沙棘油及其对照油甘油酯分子组成，发现沙棘油与其对照油甘油酯分子组成有明显差异。沙棘油中存在而其对照油中

不存在的甘油酯主要有：DAG32∶1、TAG36∶0、TAG38∶0、TAG40∶0、TAG42∶1、TAG42∶3、TAG44∶5、TAG44∶6、TAG46∶0、TAG46∶1、TAG58∶6 和TAG60∶6，因此可以通过甘油酯的检测鉴别，实现沙棘油与葵花籽油、菜籽油、大豆油及其掺假油之间的真伪鉴别。

（续表3）

（续表3）

2.3 沙棘油及其对照油甘油酯的聚类分析热力图

聚类分析法（Hierarchical clustering analysis，HCA）是指用于样本分类到组的多变量分析技术[3]。应用聚类分析结合热力分析方法，绘制层次聚类分析热力图，对各样品中所含甘油酯进行归类，并对甘油酯相对含量进行直观展示（如图2），葵花籽油与大豆油的特征甘油酯较为相似，但与菜籽油及沙棘油有较大区别，菜籽油中的特征甘油酯主要有DAG38∶2、DAG38∶4、DAG40∶2、DAG40∶3、DAG40∶4、DAG42∶1、TAG46∶3、TAG46∶4、TAG46∶5 等，沙棘油中常见的甘油三酯主要有TAG40∶0、TAG42∶1、TAG42∶3、TAG44∶5、TAG44∶6、TAG46∶0、TAG46∶1 等。通过层次聚类分析热力图可以更直观地反应沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油中各甘油三酯及甘油二酯的含量差异，证明通过甘油酯可以更简洁、直观的对食用油进行区分鉴别。

图2 沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油层次聚类分析热图Fig.2 The hierarchical clustering algorithm heatmap of sea buckthorn oil，sunflower seed oil，rapeseed oil and soybean oil

2.4 沙棘油及其对照油化学计量学分析

将UPLC-QTOF-MS 所得数据导入PeakView软件，通过MasterView 插件，结合已经建立的沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油的脂质组学数据库对所得数据进行再一次验证。将识别出的大量的甘油酯与前期数据进行对比完善，导入SIMCA 软件，进行主成分分析（PCA）及偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。PCA 表明不同种类食用油可初步区分开，但也存在交叉，主要原因是PCA 是一种无监督的分析方法，同一种食用油由于受产地、生产工艺、等级的影响，会产生较大的组内差异，当组内差异足够大时会和其它组有交叉，导致组间区分不明显；OPLS-DA 是一种有监督的判别方法，可排除无关因素、放大组间差异，反应模型的检测及预测效果。根据所得甘油酯绘制PCA 及OPLS-DA 图谱（图3）。分析可知，QC 稳定，且聚类情况明显，说明在正离子模式下试验检测状况良好。在沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油OPLSDA 图谱（图3c 和d）中，Rx2=0.964，Ry2=0.956，Q2=0.94；Q2表示累计价差有效性，Q2值越接近于1，表明模型的预测能力越好；R2为累计方差值，R2值越大，表明模型的解释能力越强，因此本次试验图谱显示了模型良好的解释能力及预测能力。

图3 沙棘油（SJY）、葵花籽油（KHZY）、菜籽油（CZY）及大豆油（DDY）PCA 及OPLS-DA 图谱Fig.3 PCA and OPLS-DA of sea buckthorn oil（SJY），sunflower seed oil（KHZY），rapeseed oil（CZY）and soybean oil（DDY）

对OPLS-DA 得分图进行200 次循环迭代置换检验（图4），以判别是否出现过度拟合的现象。图谱右侧数据为真实值，左侧数据为模拟值，当右侧Q2、R2的原始值均高于左侧Q2值、R2值，且回归截距<0.05（Q2值与y轴交于负半轴更佳），表明模型没有发生过度拟合。本试验OPLS-DA 模型数值为R2（0.0，0.129）、Q2（0.0，-0.389），Q2值与Y 轴交于负半轴，表明应用该模型对样品进行组间区分鉴别结果真实可靠，没有出现过度拟合的现象。

图4 正离子模式下200 次循环迭代OPLS-DA置换检验图Fig.4 Model validation using permutation of OPLS-DA test with 200 cycles in positive ion mode

2.5 自制掺假样品的预测分析

为判别不同食用油掺假比例，本试验建立了沙棘油及其对照油不同梯度（0%，1%，5%，10%，20%，40%，80%，100%）OPLS 模型（图5）。沙棘油与葵花籽油模型预测能力为Rx2=0.874，Ry2=0.966，Q2=0.951，校正均方根误差（RMSEE）6.02439，交叉验证均方根误差（RMSEcv）8.31966；沙棘油与菜籽油模型预测能力为Rx2=0.813，Ry2=0.988，Q2=0.982，校正均方根误差（RMSEE）5.02219，交叉验证均方根误差（RMSEcv）5.80485；沙棘油与大豆油模型预测能力为Rx2=0.854，Ry2=0.979，Q2=0.97，校正均方根误差（RMSEE）5.77894，交叉验证均方根误差（RMSEcv）6.08874。由此可知，Ry2＞0.96，截距接近于0，表明该模型具有较好的线性，依据图谱中所得检测样品生成点的位置及测得数据能够实现沙棘油掺假比例的判别。

图5 正离子模式下沙棘油及其掺假食用油不同比例观测值对预测值预测图Fig.5 Observed vs.Predicted of sea buckthorn oil and its adulterated oil in different proportionsu in positive ion mode

3 结论

本文首次采用基于UPLC-QTOF-MS 的脂质组学技术对沙棘油及其对照油（葵花籽油、菜籽油及大豆油）中脂质分子组成、甘油酯酰基链组成等进行分离检测，共检出92 种甘油酯分子，其中甘油二酯16 种，甘油三酯76 种。根据经归一化处理的甘油酯，建立PCA、OPLS-DA 模型，发现沙棘油及其对照油间聚类区分明显，能够实现沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油的有效鉴别。应用聚类分析热图对4 种食用油中甘油酯相对含量进行对比，发现各食用油甘油酯具有较大差异。通过观测值与预测值对沙棘油及其不同梯度掺假油进行预测，发觉各梯度食用油均有明显区分，能够对掺假浓度进行推测鉴别。有益于保证市场沙棘油产品质量，保障消费者相关权益，促进沙棘油企业健康、快速发展，并为后期关于沙棘油鉴别研究提供相关方法及经验。