基于iTRAQ技术研究冻藏条件对中华管鞭虾肌肉蛋白质的影响

石 娟，李勇勇，周丽萍，李超群，王 晴，娄永江

（宁波大学食品与药学学院 浙江宁波315211）

中华管鞭虾（Solenocera melantho）是我国深受欢迎的海捕虾之一[1]。虾类因富含蛋白质和水分，易腐败变质，故水产品保鲜中常采用冷冻贮藏的方式[2-3]。然而，在长时间的冻藏过程中，冷库压缩机频繁启、停造成的温度波动使细胞内冰晶不断长大，发生反复冻融现象，进而造成品质下降，如蛋白质变性、汁液流失、持水力下降等[4-6]。控制并减少冷库温度波动是提高冻藏保鲜效果的前提。

近年来，蛋白质组学技术广泛应用于水产品，如Terova 等[7]研究了鲈鱼肌肉蛋白质在不同温度贮藏过程中的变化，结果表明：有两种蛋白可能成为潜在的鲜度标志物。李学鹏[8]和赵巧灵[9]分别研究了冷藏过程中的中国对虾和金枪鱼的品质变化规律，利用蛋白质组学技术筛选出冷藏过程中与鲜度相关的指示蛋白。iTRAQ技术具有通量高、定量准确、分辨率高等优点，近年来得到广泛应用[10]。然而，从iTRAQ技术角度分析恒温冻藏过程对中华管鞭虾肌肉蛋白表达的影响未见系统研究。

通过iTRAQ技术对筛选得到的差异蛋白进行GO 分析、KEGG 富集分析，并通过Pearson 相关性分析探讨恒温冻藏和常规冻藏过程中虾肌肉品质与蛋白质变化间的相关性，旨在从分子水平上揭示虾肉在不同冻藏条件下品质变化机制及预测鲜度指示蛋白，为后续监测中华管鞭虾的新鲜度提供理论依据，为其冻藏工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中华管鞭虾购于浙江宁波某水产市场，加冰快速运至实验室。蓄冷剂由无机盐类等复配而成。

iTRAQ 标记试剂盒，美国AB SCIEX 公司；BCA 试剂盒、质谱级水（H2O）、质谱级乙腈（ACN），美国Thermo Scientific 公司；甲酸（FA），德国CNW 公司；胰酶，北京华利世公司；考马斯亮蓝G-250，美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

Q Exactive-HF 质谱仪、Easy-nLC 1200 液相系统、Orbitrap Fusion 质谱仪，上海Thermo Fisher公司；DYY-6C SDS-PAGE 凝胶电泳仪，北京市六一仪器厂；ST-360 酶标仪，上海科华实验系统有限公司；COS-03USB 温湿度记录仪，山东建大仁科电子科技有限公司；BC/BD-826HSQ 卧式冷藏冷冻转换柜，青岛海尔特种电冰柜有限公司。

1.3 方法

1.3.1 预处理 本研究采用不锈钢箱体和蓄冷剂组成一个恒温箱，将此箱置于-25 ℃的卧式冷藏冷冻转换柜中（模拟冷库），再将中华管鞭虾置于恒温箱中（箱内，XN）和冰柜中（箱外，XW）冻藏，即恒温冻藏和常规冻藏。运用iTRAQ技术分别分析箱内储存30，60，90 d（XN1、XN2、XN3）和箱外储存30，60，90 d（XW1、XW2、XW3），中华管鞭虾肌肉差异蛋白的表达情况【与新鲜组（CK）相比】，即XN1/CK、XN2/CK、XN3/CK、XW1/CK、XW2/CK、XW3/CK 6 个比较组中差异蛋白的表达情况。在-25 ℃环境下冻藏之前，先用温度记录仪连续48 h 测量箱内和箱外温度变化，恒温箱如图1所示，蓄冷剂从1 灌入。将新鲜虾冲洗、擦拭干净后，随机分成6 组，即XN1、XN2、XN3、XW1、XW2、XW3 组，分别置于箱内和箱外。冻藏完成后，样品置于-80 ℃备用。

图1 恒温箱结构示意图Fig.1 Structure diagram of thermostat

1.3.2 品质指标测定 pH 值参照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准 食品pH 值的测定》[11]进行测定。TVB-N 值参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[12]中的半微量定氮法进行测定。通过色差仪测定带壳中华管鞭虾第二、三腹节表面的明亮度（L*）、红绿度（a*）、黄蓝度（b*）[4]。取虾第二、第三腹节肌肉置于质构仪上测定其硬度、弹性；探头为直径3 mm的圆柱形，测试速度为1 mm/s，测试形变量为50%[4]。

1.3.3 蛋白提取 将研磨好的样品粉末转移至离心管并加入600 μL 酚抽提取液，加入蛋白酶抑制剂使其终浓度为1.0 mmol/L，超声3 min。加入酚-Tris-HCl（pH 7.8）饱和溶液（等体积），4 ℃混匀30 min。离心10 min，收集酚上层。加入5 倍体积预冷的0.1 mol/L 醋酸铵-甲醇溶液，-20 ℃过夜沉淀，离心后收集沉淀。向沉淀中加入5 倍体积预冷的甲醇混合用于清洗，离心后收集沉淀。以丙酮代替甲醇，重复以上步骤2 次。干燥后，溶解于样品裂解液中（3 h）。离心后取上清即为样品的总蛋白溶液，置于-80 ℃备用。

1.3.4 蛋白浓度测定 参考文献，采用BCA 蛋白浓度测定法测定蛋白质浓度[13]。

1.3.5 SDS-PAGE 电泳检测 取10 μg 蛋白，采用12% SDS-PAGE 分离，分离后的凝胶用考马斯亮兰染色法染色[14]。

1.3.6 胰蛋白酶酶解 每个样品分别取100 μg，并将各组样品调整到同浓度、同体积。分别向各组蛋白溶液中加入二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT），混匀，使其终浓度为4.5 mmol/L，在55 ℃温度条件下孵育30 min 后在冰上冷却至室温。加入相应体积的碘乙酰胺，混匀，使得其终浓度为9.0 mmol/L，室温避光条件下放置15 min。分别在各溶液中加入6 倍体积的丙酮，-20 ℃放置不少于4 h。离心10 min 收集沉淀，静置3 min 使丙酮挥发。加入100 μL 四乙基溴化铵（Tetraethylammonium bromide，TEAB）复溶沉淀，加入1 mg/mL 胰酶（20 μg），并于37 ℃消化过夜。酶解后冻干样置于-80℃保存。

1.3.7 肽段除盐 采用RP-C18 固相萃取柱脱盐。活化：取600 μL 甲醇溶液，加入到除盐柱中活化柱子，重复一次；平衡：使用600 μL 80%乙腈-水（ACN-H2O，含0.1%甲酸）冲洗2 次，再用600 μL 0.1%甲酸-水（FA-H2O）冲洗2 次；吸附样品：样品上样，靠重力自然吸附2 次；除盐：使用600 μL 0.1% FA-H2O 冲洗3 次；洗脱：用600 μL 80% ACN-H2O（含0.1% FA）靠重力自然洗脱2次，洗脱液冻干后于-80 ℃保存。

1.3.8 肽段标记 向样品中加入66 μL 200 mmol/L TEAB 缓冲液，混匀后取30 μL 标记反应。将平衡至室温的iTRAQ 试剂离心至管底，加入140 μL 异丙醇，涡流混匀，离心，重复1 次。向样品中加入75 μL iTRAQ 试剂混匀，室温条件下放置2 h 后加入200 μL 水以终止反应，放置30 min，冻干后置于-80 ℃保存。

1.3.9 反相色谱分离 将标记好的肽段采用Agilent 1100 HPLC 液相色谱进行分离，收集好样品后进行冷冻干燥，于-80 ℃保存。

1.3.10 色谱条件与质谱条件

1）色谱条件 样品以300 nL/min 的流速上样到预柱Acclaim PepMap 100 RP-C18（100 μm×2 cm，美国Thermo Fisher 公司），再经分析柱Acclaim Pep Map RSLC RP-C18（75 μm×15 cm，美国Thermo Fisher 公司）分离。流动相A：VH2O∶VFA=99.9∶0.1，流动相B：VCAN∶VH2O∶VFA=80∶19.9∶0.1；梯度洗脱条件：0～1 min，2%～9% B；1～45 min，9%～29% B；45～52 min，29%～37% B；52～56 min，37%～100% B；56～60 min，100% B。

2）质谱条件 一级分辨率为60 000，自动增益控制值（AGC）设为3×106，最大注射时间50 ms；扫描范围350～1 500m/z，并对其中10 个最高峰进行MS/MS 扫描；MS/MS 的分辨率设为15 000，AGC 设为2×105，最大注射时间为40 ms；动态排除时间设为30 s。

1.3.11 生物信息学分析 本次使用数据库NCBI-1413-IPG-Decapoda-sequence.fasta，搜库软件：Proteome Discover 2.4（美国Thermo fisher 公司）。差异筛选条件：差异倍数FC＞1.2 且P<0.05。从参与的生物过程、细胞组成和分子功能3 个方面对筛选出的差异蛋白进行GO 分析，通过KEGG 分析差异蛋白参与的信号通路。使用SAS 8.0 进行单因素方差分析及Pearson 相关性分析。

2 结果与分析

2.1 箱内、箱外温度变化趋势

箱内、箱外温度变化如图2所示，箱外温度变化约是箱内的10 倍，说明此恒温箱能较好地控制温度波动。

图2 连续48 h 箱外、箱内温度变化图Fig.2 Temperature change diagram inside and outside the box for 48 h

2.2 SDS-PAGE 电泳结果

SDS-PAGE 测定结果如图3所示。蛋白条带清晰，分布均匀，可进行后续试验。

图3 不同处理组中华管鞭虾的凝胶电泳结果Fig.3 Results of gel electrophoresis of Solenocera melantho of different treatment groups

2.3 质谱鉴定结果

本试验共得到肽段2 284 个，鉴定到的总蛋白组数为740 个。结果显示，在所有鉴定到的蛋白质中，有57.03%的蛋白质至少含有2 个肽段，大部分鉴定的蛋白质含肽段数在10 个以内（图4a）。图4b 的饼状图百分比表示不同覆盖度范围的蛋白数占总蛋白数的比例，其中37.70%的蛋白质具有超出10%的序列覆盖度。

图4 肽段数量分布图（a）和肽段序列覆盖度分布图（b）Fig.4 Peptide number distribution map（a）and peptide sequence coverage map（b）

2.4 差异蛋白筛选

不同处理组中华管鞭虾的差异蛋白结果见表1。6 个比较组中都含有上调蛋白和下调蛋白，且随着冻藏时间延长，差异蛋白数量增多，表明随着冻藏时间的延长虾肉蛋白质的变化速率加快。不同条件冻藏90 d 后箱内差异蛋白小于箱外差异蛋白数，表明恒温过程更有利于虾的保鲜。箱内3 组共筛选出30 个共有差异蛋白（表2），箱外3 组共筛选出18 个共有差异蛋白（表3），共有差异蛋白随着储存时间的延长出现上调或下调的变化趋势，这说明了共有差异蛋白发生的变化和储存时间有着紧密联系。共有蛋白可能成为冻藏过程中与虾品质相关的鲜度指示蛋白。

表1 不同处理组中华管鞭虾的差异蛋白结果Table 1 Differential protein results of Solenocera melantho of different treatment groups

表2 箱内3 组共有差异蛋白Table 2 Common differential proteins in the three inside the box

表3 箱外3 组共有差异蛋白Table 3 Common differential proteins in the three outside the box

（续表2）

2.5 生物信息学分析

2.5.1 GO 功能分析 对箱内3 组（图5）和箱外3组（图6）差异蛋白进行GO 功能分析发现，6 组差异蛋白参与的生物过程（Biological process）均主要为细胞过程（Cellular process）、生物学调控（Biological regulation）；在细胞组分（Cellular component）中均主要参与细胞（Cell）、细胞部分（Cell part）和细胞器（Organelle）；在分子功能（Molecular function）中均主要参与结合（Binding）、催化活性（Catalytic activity）及结构分子活性（Structural molecule activity）。

图5 箱内各比较组中差异蛋白的GO 功能注释图Fig.5 GO annotation of differential proteins in each comparison group inside the box

图6 箱外各比较组中差异蛋白的GO 功能注释图Fig.6 GO annotation of differential proteins in each comparison group outside the box

2.5.2 KEGG 富集分析 KEGG 是分析蛋白质在细胞中的代谢途径的主要数据库[15]。通过KEGG富集分析发现，无论箱内3 组（图7）还是箱外3组（图8）的差异蛋白都主要富集在紧密连接（Tight junction）、心肌细胞的肾上腺素信号传导（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）和心肌收缩（Cardiac muscle contraction）途径中，其中紧密连接通路富集最显著。

图7 箱内各比较组中差异蛋白的KEGG 富集气泡图Fig.7 Bubble chart of KEGG enrichment analysis of differential proteins in each comparison group inside the box

图8 箱外各比较组中差异蛋白的KEGG 富集气泡图Fig.8 Bubble chart of KEGG enrichment analysis of differential proteins in each comparison group outside the box

2.6 差异蛋白与新鲜度相关性分析

冻藏过程中虾的品质会受到多种因素的影响，使用多个指标来评价其新鲜度较为客观全面，而pH 值、TVB-N 值、色差值（L*、a*、b*值）、质构是评价其新鲜度的重要指标[16-19]。将共有差异蛋白与新鲜度指标（pH 值、TVB-N 值、L*、a*、b*值、硬度、弹性）进行相关性分析，可进一步了解差异蛋白与品质之间的相关性，进而探究虾肉品质变化机制[20-21]。中华管鞭虾在不同冻藏条件下的品质变化如表4所示。

表4 中华管鞭虾在不同冻藏条件下的品质变化Table 4 Quality changes of Solenocera melantho under different frozen storage conditions

箱内共有蛋白与品质指标的相关性分析结果表明，有8 个差异蛋白与中华管鞭虾的pH 值、TVB-N 值、色泽（L*、a*、b*值）、质构（硬度、弹性）中的其中至少一个指标呈显著相关（表5）。除了假设蛋白PF00833.14（JAI67045.1）、假设乌头酸水合酶（ROT85673.1）外，共筛选出6 个蛋白，分别是肌球蛋白重链（XP_027227239.1）、肌动蛋白（XP_027223047.1）、肌质钙结合蛋白（I2DDG2.1）、T 复合蛋白1 亚基β 样亚型X1（XP_027231689.1）、NDUFA13（AIY53011.1）、酪氨酸脱羧酶2（ROT63152.1）。肌球蛋白是与肌动蛋白相连的动力蛋白，在维持细胞形状、调控肌肉收缩、细胞移动、能量代谢等方面起着重要作用[22-24]。肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MHC）是肌球蛋白组成的一部分，具有ATP 酶活性，且能与肌动蛋白结合[25-26]。中华管鞭虾在冻藏过程中MHC 出现下调，是因为肌球蛋白会随着时间的延长不断降解，这与Shi 等[24]和马聪聪等[27]的研究结果一致。相关性分析表明其与虾a*值呈显著负相关（P＜0.05），说明MHC 的下调会影响虾肉品质。肌动蛋白随着贮藏时间的延长出现下调，相关性分析表明其与虾pH 值、b*值和硬度呈显著负相关（P＜0.05），与L*值呈极显著正相关（P＜0.01），这说明肌动蛋白的含量也会影响虾肉的pH 值、色泽及质构特性。研究表明，肌质钙结合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）一般在无脊椎动物肌肉收缩中参与反应[28-29]。在冻藏过程SCP 先表达上调，到冻藏后期表达下调，可能是由于初期虾死后僵直，参与肌肉收缩反应，为维持细胞骨架而表达上调，后期僵直解除后SCP 降解而表达下调。相关性分析结果表明SCP 与虾pH 值、TVB-N 值呈显著正相关（P＜0.05），b*值呈极显著正相关（P＜0.01），与L*值、硬度、弹性呈显著负相关（P＜0.05），说明SCP 会影响虾肉品质。T 复合蛋白1 亚基β样亚型X1 与虾pH 值、b*值呈极显著负相关（P＜0.01），与L*值呈显著正相关（P＜0.05），与TVB-N值、硬度呈显著负相关（P＜0.05），且其在3 组中均表达下调，说明此蛋白也会影响虾肉品质。研究表明，NDUFA13 的下调和抗细胞凋亡之间有一定关系[30]。相关性分析表明NDUFA13 与虾a*值呈显著负相关（P＜0.05）且在3 组中均表达下调，可能是和恒温冻藏过程中NDUFA13 抵抗细胞凋亡有关。L-氨基酸是生物体内氮代谢的重要初级化合物，氨基酸脱羧酶可以将其进一步代谢生成各种具有不同功能的生物胺，由此沟通了生物体初级代谢和次级代谢，而酪氨酸脱羧酶（Tyrosine decarboxylase，TD）仅对L-酪氨酸、L-多巴和L-苯丙氨酸等极少数底物具有活力不等的活性[31]。酪氨酸脱羧酶2（TD2）与L*值呈显著负相关（P＜0.05），说明TD2 会影响虾肉的亮度。

表5 箱内3 组差异蛋白与品质指标的相关性分析Table 5 Correlation analysis of the three groups of differential proteins and quality indicators inside the box

箱外共有蛋白与品质指标的相关性分析显示，有7 个差异蛋白与中华管鞭虾的pH 值、TVBN 值、色泽（L*、a*、b*值）、质构（硬度、弹性）中的至少一个指标呈显著相关（表6）。除了假设蛋白PF00833.14（JAI67045.1）、假设蛋白PF00307.27（JAI64922.1）外，共筛选出5 个蛋白，分别是MHC（XP_027217744.1）、MHC（MPC23537.1）、MHC（XP_027227239.1）、肌质钙结合蛋白β 链（P02635.1）、SCP（I2DDG2.1）。相关性分析结果表明，MHC（XP_027217744.1）与虾TVB-N 值呈显著正相关（P＜0.05），与弹性呈极显著负相关（P＜0.05），MHC（MPC23537.1）与虾b*值呈显著负相关（P＜0.05），MHC（XP_027227239.1）与虾弹性呈显著正相关（P＜0.05），与恒温冻藏组不同，MHC 在冻藏过程中先表达上调后表达下调，可能是随着冻藏时间的延长加上受温度波动的影响导致其表达与恒温冻藏组不同。肌质钙结合蛋白β 链与虾TVB-N 值、a*值呈显著正相关（P＜0.05）与弹性呈极显著负相关（P＜0.01），且在冻藏过程中先表达下调后表达上调，可能是由于后期完整蛋白质的降解而表达上调，从而影响虾肉品质。SCP 与虾pH 值、TVB-N 值、a*值和硬度呈显著正相关（P＜0.05）与L*值呈显著负相关（P＜0.05），且蛋白表达和恒温冻藏一致。

表6 箱外3 组差异蛋白与品质指标的相关性分析Table 6 Correlation analysis of three groups of differential proteins and quality indicators outside the box

恒温冻藏和常规冻藏共有的差异蛋白为肌球蛋白重链和肌质钙结合蛋白，这2 个蛋白可能成为与冻藏中华管鞭虾品质变化的蛋白指示物，且从两者的差异蛋白在冻藏过程中的变化和各项鲜度指标可得恒温冻藏的保鲜效果优于常规冻藏。

3 结论

本研究筛选出恒温冻藏和常规冻藏的差异蛋白均主要分布在细胞、细胞部分和细胞器中；分子功能分类中主要分布在结合、催化活性及结构分子活性；筛选出肌球蛋白重链和肌质钙结合蛋白与中华管鞭虾的pH 值、TVB-N 值、L*、a*、b*值其中至少一个指标呈显著相关；恒温冻藏保鲜效果优于常规冻藏。本研究从iTRAQ技术角度揭示了中华管鞭虾在冻藏过程中的品质变化机理，同时此恒温箱放大即可以当作冷库，为企业冷库的改良提供了参考。