副干酪乳杆菌PC-01益生特性和安全性研究

2021-12-17刘凯龙康小红王记成

中国食品学报 2021年11期

刘凯龙，康小红，张哲，郭帅，王记成*

（1 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室呼和浩特010018 2 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司呼和浩特011500 3 中国食品发酵工业研究院有限公司中国工业微生物菌种保藏中心北京100015）

干酪乳杆副菌（Lactobacillus paracasei，L.paracasei）是一种革兰氏阳性同型发酵乳酸菌，是乳杆菌属的重要成员，广泛存在于人体肠道、传统发酵乳制品和泡菜等环境中[1]。有研究表明，优良的干酪乳杆副菌具有较好的抗胃肠道消化能力等益生特性且对宿主安全[2]。其代谢物如有机酸和细菌素等可抑制病原菌生长[3-6]。通过胞外酶作用分解蛋白产生的小肽分子具有降血压、抗肿瘤和抗氧化等功能[7]，在健康和功能性食品中得到广泛应用[8]。

益生菌制剂在肠道疾病治疗中的作用得到大量临床研究证实，然而，其安全性问题也日渐凸显[9-12]。益生菌对肠道细胞具有较好黏附作用，可导致细菌易位概率增加；免疫刺激和调节作用可能引起免疫系统改变[13]；抗生素药物滥用已成卫生安全隐患，益生菌与病原菌之间耐药基因交换能导致菌株携带抗药性基因[14]。2002年联合国粮农组织和世界卫生组织（FAO/WHO）的报告指出，一般认为乳酸菌是安全的，然而，在理论上可能存在一些毒副作用，因此需要对抗生素敏感性和毒性进行安全性评估。

目前，有许多可供参考的益生菌株体外筛选方法[15-18]。本研究以分离自西藏拉萨地区当雄县龙仁乡酸牦牛奶的副干酪乳杆菌PC-01 为对象，结合人工胃肠液耐受性、胆盐耐受性以及安全性进行综合评估，为其实际应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源副干酪乳杆PC-01，（保藏号CGMCC No.17537）中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。对照菌株：副干酪乳杆菌LC-01，科汉森（中国）有限公司。

1.1.2 仪器与试剂 MRS 培养基，广州环凯微生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，美国Sigma公司；牛胆盐，北京奥博生物技术公司；抗生素检测试剂条，法国生物梅里埃。

电热恒温水浴锅，天津知署科技有限公司；立式低速离心机，德国Eppendorf 公司；恒温培养箱，上海恒科技仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 副干酪乳杆菌PC-01 潜在益生特性研究

1.2.1.1 菌株活化将冷冻保存的副干酪乳杆菌PC-01 于37℃培养活化传代2～3 次，4℃保存，待用。

1.2.1.2 人工模拟胃肠液的配制

1）人工模拟胃液 NaCl 0.2 g/100 mL、胃蛋白酶（Pepsin）0.35 g/100 mL，用1 mol/L HCl 调整pH 值为2.50，过滤除菌备用。

2）人工模拟肠液胰腺液配制方式：重碳酸钠1.1 g/100 mL，NaCl 0.2 g/100 mL，胰蛋白酶0.1 g/100 mL，调整pH 值为8.0，过滤除菌备用。胆汁液配制方式如下所示：牛胆盐1.8 g/100 mL，调整pH 值为8.0，过滤除菌备用[19]。将上述胰腺液和胆汁液以体积比2∶1 混合即为人工肠液。

1.2.1.3 模拟胃肠液耐受性测定参考Bao 等[20]的方法，将培养活化至2 代的菌株离心（2 000×g、10 min），弃上清液，加5 mL 灭菌磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH=7.2）混匀制成菌悬液。取1 mL 菌悬液于9 mL 人工模拟胃液（pH 2.5）中，混匀后于37 ℃下培养，分别在0 h 和3 h 取样，测定活菌数。3 h 后无菌条件下取1 mL 到模拟肠液中37 ℃培养计为肠液0 h，在肠液中培养8 h（总11 h）后取样测定活菌数，并按下式计算存活率：

式中，N0——0 h 的活菌数，CFU/mL；N1——模拟胃液处理3 h（肠液0 h）的活菌数，CFU/mL；N2——模拟肠液处理8 h（总11 h）后的活菌数，

CFU/mL。

1.2.1.4 胆盐耐受能力的测定将活化好的菌种按1%的接种量接种于含胆盐的MRS 液体培养基中（培养基中添加0.2 g/100 mL 巯基乙酸钠，0.3 g/100 mL 牛胆盐）和不含胆盐的MRS 培养基中，37 ℃培养，每隔1 h 取样并测定其在波长620 nm下的OD 值，直到其OD620nm值增加0.3 个单位以上停止培养[21]，计算菌株在含胆盐和不胆盐的MRS 培养基中OD620nm值增加0.3 个单位的时间差，即为延迟时间（Later time，LT）[22]。

1.2.2 副干酪乳杆菌PC-01 安全性评价

1.2.2.1 溶血试验将活化后的副干酪乳杆菌PC-01 接种于MRS 液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h 后，将菌悬液点种于血平板上（3 个重复），于37 ℃培养72 h，以金黄色葡萄球菌和英诺克李斯特菌分别为阳性、阴性对照菌株，观察是否有溶血现象。如不出现溶血圈，说明该菌株能够作为潜在益生菌，反之剔除。具体参照GB 4789.11-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验 β 型溶血性链球菌检验》检测方法。

1.2.2.2 药物敏感性检测依据CLSI M45-2016《苛养菌少见菌药敏判断标准》对氨苄西林（AMP）、克林霉素（CM）、利奈唑氨（LZ）、美罗培南（MP）、亚胺培南（IP）、红霉素（EM）、达托霉素（DPC），万古霉素（VA）8 种抗菌药物的最小抑制浓度进行测定[23]，以MRS 培养液为稀释液，采用试管两倍稀释法对药物做不同浓度稀释，于37 ℃厌氧培养24 h，观察菌株生长情况，其耐药性判定标准参考《苛养菌少见菌药敏判断标准》判断。

1.2.2.3 生物胺的测定菌种产生的生物胺是由于细菌底物特异性酶使氨基酸脱羧形成的。取副干酪乳杆菌PC-01 发酵液5 mL 离心（6 000×g、5 min），取湿菌体加入体积分数10%三氯乙酸沸水浴提取1 h，取上清液衍生，生物胺的定量分析采用高效液相色谱仪（HPLC）测定，具体的参照GB 5009.208-2016 《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》（第一法），其样品检出限为：腐胺、组胺、酪胺1.25 mg/kg，尸胺0.75 mg/kg。

1.2.2.4 致病性评价依据《食品用菌种致病性评价程序（征求意见稿）》对副干酪乳杆菌PC-01进行致病菌评价。具体如下：受试小鼠80 只雌雄各半，随机分成4 组（每组10 只），包括培养基原液对照、培养物原液、培养基浓缩液对照以及培养物浓缩液，每只小鼠体内注射20.0 mL/kg BW 副干酪乳杆菌PC-01 培养物，观察副干酪乳杆菌PC-01 培养物分别对雌雄小鼠体质量以及毒副作用的影响，具体评价参照保健食品用菌种致病性评价程序附录A。

1.3 数据处理

人工胃肠液、胆盐各试验数据以均值±标准差（±s）表示，统计分析使用SPSS 22.0 软件，显著性水平设定为P<0.05。

2 结果与讨论

2.1 副干酪乳杆菌PC-01 对人工胃肠液的耐受性

副干酪乳杆菌PC-01 经人工胃液消化3 h后，随即转入pH 值为8.0 的人工肠液，消化8 h后活菌数变化如表1所示。在pH 2.5 的人工胃液中培养3 h 后，其存活率为87.27%，高于对照组副干酪乳杆菌LC-01（82.39%）。转入pH 8.0 人工肠液消化8 h 后存活率为88.60%，显著高于对照菌株LC-01（73.22%），表明副干酪乳杆菌PC-01 有较好人工胃肠液耐受能力。

表1 供试菌株在pH2.5/8.0 人工胃肠液消化后活菌数及存活率情况（n=3，±s）Table 1 Viable count and survival rate of tested strains after digestion with artificial gastrointestinal fluid at pH 2.5 / 8.0（n=3，±s）

注：不同字母表示同一列显著性差异（P＜0.05），下同。

菌株人工胃液（pH 2.5）人工肠液（pH 8.0）0 h×108/CFU·mL-1 3 h（肠液0 h）×108/CFU·mL-1存活率/%8 h×108/CFU·mL-1存活率/%LC-01（对照菌株）9.20±0.07a7.58±0.03a82.395.55±0.04a73.22 PC-018.01±0.14b6.99±0.08d87.276.19±0.04c88.60

2.2 副干酪乳杆菌PC-01 对胆盐的耐受性

由表2 可知，当副干酪乳杆菌PC-01 在不含胆盐的培养基中培养时，OD620nm值增加0.3 个单位所需时间为2.17 h；在含有胆盐的培养基中培养，OD620nm值增加0.3 个单位所需时间为2.51 h，延迟时间为0.34 h。与对照组LC-01（0.61±0.01）h 相比，副干酪乳杆菌PC-01（0.34±0.07）h 具有更高的耐受性（P＜0.05），说明副干酪乳杆菌PC-01 具有在肠道内存活继而发挥抗氧化应激作用的潜力。

表2 供试菌株对胆盐耐受性结果（n=3，±s）Table 2 Results of bile salt tolerance on tested strains（n=3，±s）

菌株A620nm 增0.3 个单位所需时间/h MRS-巯基乙酸钠MRS-巯基乙酸钠+牛胆盐LT LC-01（对照菌株）3.48±0.03a4.09±0.06a0.61±0.01a PC-012.17±0.07d2.51±0.08d0.34±0.07b

2.3 副干酪乳杆菌PC-01 安全性评价

2.3.1 溶血试验结果本试验经穿刺接种血平板后，副干酪乳杆菌PC-01 在穿刺内核穿刺处的周围未出现透明圈，如图1所示。副干酪乳杆菌PC-01 与阴性对照菌CICC10417 英诺克李斯特菌溶血效果相似，与阳性对照菌CICC10473 金黄色葡萄球菌有显著差异。试验结果表明，副干酪乳杆菌PC-01 没有引起溶血现象且呈阴性。

图1 副干酪乳杆菌PC-01 溶血情况Fig.1 Hemolysis of Lactobacillus paracasei PC-01

2.3.2 药物敏感性及生物胺检测结果由表3 可知，副干酪乳杆菌PC-01 对氨苄西林、利奈唑氨、美罗培南、亚胺培南、红霉素达托霉素6 种抗生素敏感，对万古霉素和克林霉素有耐受性。此外本试验研究了副干酪乳杆菌PC-01 对生成生物胺所涉及氨基酸的脱羧能力进行测定。在食品中，低含量的生物胺可认为是安全的，然而摄入过量时可能会引起独特的药理、生理和毒性效应[23]。本研究经HPLC 分析，未检测到腐胺、组胺、酪胺以及尸胺。表明副干酪乳杆菌PC-01 是安全性菌株，可应用于食品行业。

表3 副干酪乳杆菌PC-01 的MIC 值及药敏性结果Table 3 MIC values and drug sensitivity results of Lactobacillus paracasei PC-01

2.3.3 致病性评价结果

2.3.3.1 副干酪乳杆菌PC-01 培养物的活菌数副干酪乳杆菌PC-01 培养物活菌计数结果如表4所示。培养物中含有副干酪乳杆菌PC-01 的数量为5.2×107CFU/mL。

表4 副干酪乳杆菌PC-01 计数结果（CFU/mL，n=3，±s）Table 4 Count results of Lactobacillus paracasei PC-01（CFU/mL，n=3，±s）

注：表中1，2，3 代表三次平行测定；本试验的接种量为0.1 mL。

稀释度123平均数计数结果×107 10-554475652.3±4.75.2±0.16 10-65555.0±0.0

2.3.3.2 副干酪乳杆菌PC-01 培养物对小鼠体质量的影响副干酪乳杆菌PC-01 培养物通过腹腔注射途径干扰实验小鼠，结果如表5 和6所示。实验期间，小鼠初始体质量及终体质量在培养物组和其它组间组比较均无显著差异（P＞0.05），未观察到实验小鼠明显的活动或行为变化、疾病或死亡，实验证实了副干酪乳杆菌PC-01 培养物对小鼠的体质量无影响，该菌株对动物的健康状况、生长发育没有明显的口服毒性影响，与小鼠无临床症状一致。

表5 副干酪乳杆菌PC-01 培养物对雄性小鼠体质量的影响Table 5 Effects of Lactobacillus paracasei PC-01 culture on body weight of male mice

表6 副干酪乳杆菌PC-01 培养物对雌性小鼠体质量的影响结果Table 6 Effects of Lactobacillus paracasei PC-01 culture on body weight of female mice

2.3.3.3 副干酪乳杆菌PC-01 培养物对小鼠急性毒性作用以20.0 mL/kg BW 的剂量给小鼠连续灌胃副干酪乳杆菌PC-01 培养物原液和5 倍浓缩液3 d，观察7 d，具体结果如表7所示。小鼠在灌胃培养物原液、5 倍浓缩液后，受试小鼠体征、行为未有发生疾病、中毒或死亡急等现象，证明该菌株是安全的。

表7 副干酪乳杆菌PC-01 培养物对小鼠急性毒性作用Table 7 Acute toxicity of Lactobacillus paracasei PC-01 culture in mice

3 结论

分离自西藏拉萨地区当雄县龙仁乡酸牦牛奶的副干酪乳杆菌PC-01 可在pH 2.5 条件下生长，具有一定的耐酸性，经pH 8.0 的人工肠液液消化8 h 后，其存活率仍可达88.6%，能较好耐受人工胃肠液并且具有较高的胆盐耐受性，表明副干酪乳杆菌PC-01 是一株具有潜在益生特性的乳酸菌。此外，副干酪乳杆菌PC-01 对万古霉素和克林霉素耐药，溶血试验和致病性试验显示该菌株具有安全性。综上，副干酪乳杆菌PC-01 具有良好的益生特性和使用安全性。