番石榴叶药材质量标准研究

鲍 锋 赵室梅 杨 文 孙 刚 李开斌

贵州省安顺市食品药品检验所，贵州 安顺 561000

番石榴叶别名鸡矢茶、番桃叶等，为桃金娘科植物番石榴(PsidiumguajavaLinn)的干燥叶，在沿海及西南诸省均有分布[1-3]。其性平，味涩，微苦。归大肠、肝经，具有燥湿健脾，清热解毒，收敛止泻的功效；主治泻痢腹痛、食积腹胀、齿龈肿痛、风湿痹痛、湿疹臁疮、疔疮肿毒、跌打损伤、外伤出血、蛇虫咬伤等[1-3]。现代药理研究[5-8]表明番石榴叶主要具有降血糖血脂、抗氧化、抗病毒、抗菌抗、肿瘤等活性。番石榴叶主要含萜类、黄酮类、酚类、多糖、挥发油等成分，黄酮类是其重要的活性成分[9-11]，选择黄酮类作为该药材的质量控制指标，以金丝桃苷[12]和异槲皮苷作为质量评价指标，采用HPLC测定其含量，进行质量标准研究，为规范药材质量，保证临床疗效提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；梅特勒AB-265型电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；LEIKCA DM500显微镜和LAS EZ显像系统(德国莱卡公司)；DHG-9041A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 材料 番石榴叶药材由课题组采自贵州，广西和广东等地，具体信息见表1，由贵州中医药大学药学院药用植物栽培与鉴定教研室魏生华教授鉴定为桃金娘科植物番石榴(PsidiumguajavaLinn)的干燥叶；乙腈为色谱纯( 天津市科密欧化学试剂有限公司)，其余所用试药试剂均为分析纯；番石榴叶对照药材由中国食品药品检定研究院提供(批号:121212-0101)、槲皮素对照品(批号：100081-201610)、金丝桃苷对照品(批号:111521-201507，含量94.3%)、异槲皮苷对照品(批号:111809-201403，含量92.9%)均由中国食品药品检定研究院提供。

表1 供试样品来源表

2 方法与结果

2.1 性状鉴别[13]番石榴叶药材性状为皱缩、卷曲或破碎，完整者展平后呈长椭圆形或长卵形，长5～13cm，宽3～6cm；先端急尖或钝，基部钝圆形，全缘。上表面深绿色至棕黄绿色，疏生黑褐色小腺点，嫩时疏生短毛；下表面暗绿色至灰褐色，密被白色短柔毛，主脉隆起，侧脉7～11对，于近边缘处相连。质硬而脆。气微，揉之有香气，味涩。如图1所示。

图1 番石榴叶药材图

2.2 显微鉴别[13]

2.2.1 横切面 通过观察番石榴叶的横切片，其显微鉴别特征如下。

上表皮为1列细胞，扁平，有的向外突起形成非腺毛；上表皮下方厚角组织3～7层，下表皮细胞较小，下表皮厚角组织2～3层，均有含晶细胞及溶生型分泌腔分布。海绵组织不发达，草酸钙簇晶分布于叶肉组织。主脉维管束外韧型，束鞘纤维断续成环[15]。如图2所示。

1.上表皮；2.厚角组织；3.木质部；4.韧皮部；5.分泌腔； 6.下表皮；7.海绵组织。番石榴叶横切面1.草酸钙晶体；2.上表皮；3.韧皮部；4.厚角组织；5.分泌腔；6.木质部。番石榴叶横切(主脉维管束)图2 番石榴叶药材横切图

2.2.2 叶表面观 上表皮细胞类方形或不规则多边形，排列紧密，细胞壁稍增厚，气孔稀少；上表皮散在的油细胞较多，油细胞周围被7～9个排列整齐的表皮细胞包围；上表皮细胞内含有较多草酸钙簇晶。下表皮细胞多为多边形；气孔较密集，均为平轴式，保卫细胞新月形，副卫细胞2个；单细胞非腺毛较多，油细胞分布较稀疏。如图3所示。

番石榴叶上表皮显微特征图 番石榴叶下表皮显微特征图图3 番石榴叶药材叶表皮显微图(×40)

2.2.3 粉末鉴别 通过对10个药材样品的粉末进行观察和测量，其显微鉴别特征总结如下：本品粉末呈黄绿色或草绿色；非腺毛单细胞，有的初生壁与次生壁分离皱缩，长20～350 μm，直径约10 μm。草酸钙簇晶多见，直径10～30 μm，偶见菱晶。导管多成束，多为螺纹导管, 偶见网纹导管, 直径8～20 μm；纤维多成束散在，长条形，直径约12 μm；表皮细胞多见，类方形或不规则多角形；气孔突起，副卫细胞2个。分泌腔多破碎，完整者呈类圆形或类长圆形，周围分泌细胞含淡黄色或棕色物。如图4所示。

1.草酸钙结晶(a、簇晶 b、棱晶); 2.导管(a、螺纹 b、网纹);3.纤维束;4.非腺毛;5.表皮细胞图4 番石榴叶药材粉末显微图(×40)

2.3 对照品鉴别

2.3.1 对照品薄层鉴别[13]取本品粉末1 g，精密加入80%乙醇20 mL，盐酸1 mL，加热回流1 h，滤过，浓缩滤液至5 mL作为供试品溶液，另取槲皮素对照品，加80%的乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%的三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱图中，在与对照品相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。如图5所示。

S1～S10.10批番石榴叶药材a槲皮素对照品图5 番石榴叶药材样品TCL图

2.3.2 对照药材薄层色谱鉴别 取番石榴叶粉末1 g置锥形瓶中，加水20 mL，加热回流30 min,放冷，过滤，滤液用乙醚萃取两次，每次10 mL，合并乙醚层，蒸干，残渣用5 mL乙醚溶解作为供试品溶液，另取番石榴叶对照药材，同法制得对照药材溶液。吸取上述两种溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%的香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点清晰，在与对照药材相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。如图6所示。

S1～S10.10批番石榴叶药材 A1番石榴叶对照药材图6 各样品TLC图

2.4 成分检查 对10批不同产地番石榴叶药材进行检查。

2.4.1 水分 按照中国药典2015年版(四部)通则0832第二烘干法[4]测定10批药材的含水量为10.1%～13.6%，平均值11.3%。

2.4.2 总灰分 按照中国药典2015年版(四部)通则2302灰分规定项下总灰分测定[4]测定10批药材中总灰分的含量为4.8%～6.9%，平均值5.5%，暂定总灰分6.5%。结果见表2。

2.4.3 酸不溶性灰分 按照中国药典2015年版(四部)通则 2302灰分规定项下酸不溶性灰分测定法[4]测定10批药材中酸不溶性灰分的含量为0.1%～0.6%，平均值0.3%。结果见表2。

表2 10批番石榴叶药材的检查项测定结果 (n=10)

2.4.4 醇溶性浸出物 按照中药典2015年版(四部)通则 2201醇溶性浸出物项下热浸法测定[4]。 以70%乙醇为溶剂，测定10批药材中醇溶性浸出物的含量为浸出物在18.6%～35.2%范围内，平均值为29.2%。

2. 5 样品含有量测定

2.5.1 色谱条件[14]色谱柱为Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液(13∶87)恒度洗脱，柱温25 ℃，检测波长257 nm；流速1.0 mL/min；进样体积为10 μL。在此色谱条件下，其他成分对金丝桃苷、异槲皮苷的色谱峰无干扰。 对照品及样品色谱图。如图7所示。

2.5.2 标准溶液的制备[14]分别精密称取金丝桃苷对照品10.61 mg，异槲皮苷对照品10.78 mg，分别置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液各3 mL于同一25 mL容量瓶中，加60%甲醇溶液稀释至刻度即得。

2.5.3 供试品溶液的制备[14]取番石榴叶粉末(过四号筛)约0.2g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入60%甲醇20 mL，超声提取(功率500W,频率40kHz)40 min，取出放冷，用60%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.5.4 方法学考察[14]线性关系考察、稳定性和重复性考察，仪器精密度、加样回收率试验和耐用性考察均满足含量测定要求。

2.5.5 样品测定 对表1所有样品照2.5.3项下方法提取供试品溶液，测定含量，按干燥品计算药材中金丝桃苷与异槲皮苷的总量，结果见表3，HPLC 色谱图如图7所示。

图7 混合对照品HPLC图

图8 10批番石榴叶药材HPLC图

表3 各成分含有量测定结果 (n=3)

3 讨论

3. 1 薄层色谱条件选择 槲皮素薄层鉴别时，考察甲苯-氯仿-丙酮-甲酸(8∶5∶7∶1)[13]、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸等展开系统，结果选用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.5)为展开剂，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视，结果分离度好、斑点清晰。对照药材鉴别时，考察甲苯-三氯甲烷-甲酸、三氯甲烷-丙酮-甲酸和二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸等展开系统，结果选二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%的香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点清晰，日光下检视，结果分离度好、斑点清晰，斑点色彩层次分明。结合对照品与对照药材鉴别，该方法具有简便易行、分离度好、斑点清晰、特征性强等优点，可以作为番石榴叶药材的鉴别。

3.2 对照品分析 10批样品都含有金丝桃苷和异槲皮苷，但从含量测定结果看，不同产地批次之间两者含量差异较大，同产地不同采收时间两者之间也存在较大差异。 但总体来说，10批番石榴叶药材金丝桃苷与异槲皮苷总量均超过0.3%，含量是否与采收时间、产地和保存条件和保存时间有关联，课题组将继续探索。

3. 3 HPLC条件选择 分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水 ( 含 0.1% 甲酸) 、乙腈-水(含0.1%甲酸)等不同比例洗脱溶剂对HPLC色谱图的影响，结果显示乙腈-水(含0.1%甲酸) 为较优洗脱溶剂; 并结合全波长扫描，结果显示在“2.5.1”项色谱条件下，化合物分离效果最好。

3.4 含有量限度确定 考察了10批番石榴叶药材，金丝桃苷与异槲皮苷含有量差异较大，两者的总量介于2.586～5.887 mg/g，平均含有量 4.124 mg/g；故应以最低测定值设限，可暂定番石榴叶中黄酮醇苷限度应≥2.5mg/g。初步用于控制该药材质量，为制定番石榴叶的质量标准提供科学依据。

本文对番石榴叶药材质量标准作了较深入的研究，提出了较系统的质量标准方案，为番石榴叶质量标准的制定提供了较详实的实验室研究基础，但在有害元素、农药残留及真菌毒素等方面的控制与安全评价的研究尚未开展，课题组还有待进一步研究。