结直肠癌少见基因变异的临床诊疗进展*

孟令男 刘浩 聂勇战 樊代明 卢瑗瑗

目前国内外结直肠癌（colorectal cancer，CRC）诊疗指南普遍推荐患者进行的基因检测有KRAS、NRAS、BRAF 和MSI 状态检测，并根据KRAS/NRAS 的突变状态制定使用EGFR 单抗治疗的方案。然而，随着全面基因组测序分析技术等先进的测序技术在临床中应用的迅速进展，发现在2%～7%的结肠癌中[1-3]受体酪氨酸激酶（RTKs）发生了遗传学改变，如基因突变、扩增和激活重排等，这意味着大量患者存在目前临床尚未检出的致癌驱动基因改变，是潜在靶向治疗的获益人群。本文就CRC 少见基因变异（包括基因突变、扩增和重排等）的临床诊断和相应治疗策略进展进行综述，期盼这部分患者得到更加精准的个体化治疗（表1）。

表1 CRC 少见基因变异及疗效预测

1 ERBB2 突变或扩增

5%～7%的CRC 患者中存在HER2 体细胞突变或扩增。目前已有报导确认的HER2 点突变位点有S310F、L755S、V777L、V842I 和L866M。HER2 的这些激活突变和扩增能够激活下游信号通路，且对EGFR 单抗治疗产生原发性耐药[4]。一项多中心、开放标签的Ⅱ期验证性研究HERACLES，揭示了曲妥珠单抗联合拉帕替尼双靶向治疗对于难治性KRAS野生型、HER2 阳性的转移性结直肠（mCRC）的疗效[5]。913 例患者中，有44 例HER2+（4.8%），经曲妥珠单抗和拉帕替尼治疗后客观缓解率（objective response rate，ORR）达到35%，中位无进展生存期（progression-free survival，PFS ）达5.5 个月。生存结果显示，HER2 基因拷贝数更高的患者接受抗HER2 治疗后的生存更好。既往在CRC 中缺乏明确的HER2 检测标准，HERRACLES 试验也提出应用IHC/FISH 方法检测HER2 表达的具体标准，将HER2 阳性定义为≥50%细胞IHC HER2 3+或2+，同时FISH 阳性（HER2：CEP17≥2），比HER2 在乳腺癌和胃癌中的阳性诊断标准更为严格。作为HERACLES 的升级版， HERACLES-B 研究的不同之处在于纳入标准中增加了BRAF 基因为野生型，对治疗方案也进行了升级[6]，选用了更强效的帕妥珠单抗与T-DM1（曲妥珠单抗与emtansine 偶联的ADC 药物）联合治疗。研究结果显示ORR 为9.7%，低于预设的主要终点（ORR 30%），但其病情稳定达67.7%，中位PFS 为4.1 个月。该研究结果虽然是阴性，但这种新型抗HER2 治疗显示了良好的治疗前景，其带来的PFS 获益与之前的HERACLES 研究（4.2 个月）类似，且安全性良好。MyPathway 是一项多中心的IIa 期研究，含有多个队列的篮子试验，旨在对含有HER2、BRAF、EGFR 或Hedgehog 通路活化的肿瘤患者评估相应靶向治疗药物的疗效。在该试验的亚集分析中，对于含有HER2基因变异（扩增、突变或过表达）的难治性mCRC 患者给予帕妥珠单抗+曲妥珠单抗治疗。入组的57 例mCRC 患者中，ORR 达32%，与HERACLES 研究的ORR 相似，结果获得广泛关注[7]。MOUNTAINEER是一项多中心、公开标签的单臂Ⅱ期试验，与前两项研究相似，入组患者为经化疗和抗VEGF 抗体治疗后无效的RAS 野生型mCRC 患者，且伴有HER2 扩增或过表达。采用曲妥珠单抗联合妥卡替尼（HER2 高选择性口服小分子激酶抑制剂）治疗后，评估其ORR。截至2019年4月，入组的26 例患者中22 例完成了评估，ORR 达55%，临床获益率高达64%，中位PFS为6.2 个月，中位总生存期（overall survival，OS）为17.3 个月，是目前mCRC 经抗HER2 治疗结果最为理想的研究，提示了该种治疗方案的强大潜力[8]。根据这一结果，研究人员扩大试验范围，以便更好地评估ORR 和安全性，但目前试验结果暂未被报道[9]。近期Lancet Oncology 上报道了DESTINY CRC01 研究[10]，使用新型抗体偶联药物trastuzumab deruxtecan（DS-8 201）治 疗HER2 过 表 达（IHC HER2 3+或HER2 2+且FISH 阳性）的mCRC 患者。该研究纳入RAS 和BRAFV600E 野生型、既往经历过两种以上治疗方案的mCRC 患者，ORR 为45.3%（24/53），中位PFS 为6.9 个月，中位OS 为15.5 个月，疗效较好。但在IHC HER2 2+且FISH 阴性及IHC HER2 1+的分组中，患者未获得明确疗效。目前，评估DS8201在5.4 mg/kg 和6.4 mg/mg 剂量下对HER2 过表达的mCRC 患者的疗效和安全性的Ⅱ期临床试验正在进行中（DESTINY-CRC02）[11]。

2 BRAF 基因突变

BRAF 基因位于染色体7q34，负责编码RAF 激酶蛋白，该蛋白属于MAPK/ERK 信号通路的一部分[12-13]。其中V600E 是最常见的BRAF 基因突变，即BRAF 基因的CR3 激酶结构域内的第15 号外显子上第600 位的氨基酸由缬氨酸（V）突变为谷氨酸（E）[12，14]。该种突变导致MAPK 通路激活，启动下游的基因转录，导致了细胞的无限增殖和分裂[15]。约10%的mCRC患者存在BRAF 基因突变，最常见的类型为BRAF V600E 突变，约占BRAF 突变的90%，这类突变的CRC 通常局限于右半结肠，且分化较差、呈黏液性，更易发生淋巴结和腹膜转移[16]。它多发于老年女性，并与高度微卫星不稳定性（MSI-H）有一定相关性[16]。有证据显示，BRAF 基因突变患者预后差，生存期短，既往常规治疗后生存期也仅为野生型患者的一半[17]。

在BRAF 抑制剂维莫非尼、达拉非尼等被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗BRAF 突变的不可切除或转移性黑色素瘤后，BRAF 抑制剂在治疗mCRC 上也被寄予厚望[12]。但与BRAF 突变的黑色素瘤相比，BRAF 抑制剂在mCRC 单药治疗中的疗效较差，ORR 仅为5%左右，但其联合其他靶向治疗如抗EGFR、MEK 抑制剂或PI3K 抑制剂则很有前景[12]。在一项Ⅰb 期研究中，18 例BRAF 突变且KRAS 野生型的mCRC 患者使用不同剂量的维莫非尼联合伊立替康和西妥昔单抗（VIC 方案）时，在35%（6/17）的患者中观察到影像学缓解，中位PFS 为7.7 个月[18]。基于该Ⅰb 期研究的成功，Kopetz 等开始探究VIC 方案是否在既往治疗失败的BRAF 突变的mCRC 中较IC 方案更有效。SWOG S1406 研究[19]将既往接受过1 种或2 种方案治疗的106 例BRAF 突变的mCRC 患者随机分为两组，分别给予VIC 方案及IC 方案的系统治疗。初步结果显示，加入维莫非尼后改善了患者的PFS（中位PFS ：4.4 个月vs.2.0 个月），VIC 组的客观有效率和疾病控制率也显著高于IC 组(ORR：16%vs.4%，P=0.09；DCR：67%vs.22%，P＜0.001)。VIC 联合化疗方案不受既往伊立替康治疗、MSI 状态、PIK3CA 突变或肿瘤部位影响，而且IC 方案治疗后进展的患者，联合维莫非尼治疗仍然有效。2020年SWOG S1406 研究的最终结果显示，西妥昔单抗联合伊立替康加入维莫非尼后中位PFS 明显延长（4.2 个月vs.2.0 个月），两组ORR 分别为17%和4%，DCR 为65% 和21%[20]，给BRAF 突变的mCRC患者带来了希望。另一项开放标签的大型Ⅰ/Ⅱ期研究评估了142 例BRAF 突变的mCRC 患者使用BRAF/MEK/EGFR 抑制剂的疗效，结果令人振奋。与双药靶向联合疗法相比，三药联合疗法的ORR 更好（21%vs.0），但是中位OS 并没有延长（9.1 个月vs.8.2个月）[21]。与之相同，2021年一项开放标签、全球性、三臂的Ⅲ期临床研究BEACON 数据分析也得出类似的结果[22]。该研究评估了使用康奈非尼加西妥昔单抗联合或不联合比美替尼治疗既往1～2 种方案治疗后进展的BRAF V600E 突变的mCRC 患者的安全性与疗效。入组的665 例患者随机分为三药靶向组、双药靶向组和西妥昔单抗联合伊立替康或FOLFIRI 的对照组（1∶1∶1）。三组的中位OS 分别为9.3、9.3 和5.4 个月，三组的ORR 分别为26.8%、19.5%和1.8%。与对照组相比，三药联合和双药联合治疗方案中位OS 明显延长，ORR 也明显改善。双联靶向与三联靶向疗法的生存获益无显著性差异，还降低了不良事件发生率（57.4%vs.65.8%）[22]。基于BEACON 研究结果，FDA 首先批准了双靶治疗，2021年版NCCN 指南也推荐康奈非尼联合西妥昔单抗或帕尼单抗用于BRAF 突变CRC 患者的二线或后线治疗（表2）。

表2 BRAF V600E 突变mCRC 癌患者中涉及BRAF 靶向治疗的临床试验

3 蛋白激酶基因组重排产生融合基因

由蛋白激酶的基因组重排产生融合基因在CRC中已有报道，但是种类和发生几率未知[23]。美国一项研究应用全面基因组测序分析技术检测了18 407 例CRC 样本和513 例ctDNA 样本，在126 例CRC 组织样本（0.68%）和7 例ctDNA 样本（1.36%）中鉴定出激酶重排（kinase rearrangements，KRE）。最常见的激酶包括RET（22%）、BRAF（22%）、NTRK1（16%）和ALK（13%）。其他少见的KRE 还包括EGFR、FGFR3、FGFR1、ROS1、RAF1、FGFR2、NTRK3、PDGFRB、MET 和NTRK2。发生KRE 的肿瘤患者中52%（69/133）为女性，中位年龄为62 岁。在KRE 病例中，最常见的非激酶基因突变是TP53（67.7%）、APC（39.1%）、RNF43（30.1%）和MLL2（21.1%），且90%的病例KRAS 状态为野生型[23]。

3.1 ALK/ROS1 基因重排

ALK 基因重排在CRC 患者中很少见，频率为0.05%～2.5%[24]。已报道CRC 中发生ALK 融合的伴侣基因包括EML4、SPTBN1、CAD、SMEK2、STRN、SENPF、MAPRE3、PRKAR1A、C2orf44和PPP1R21 等[24-25]。相对于野生型ALK 需要配体结合后激活激酶活性，ALK 融合蛋白结构性激活下游信号转导通路（如STAT3、AKT 和MAPK 通路等）不需要配体结合，即可促进细胞恶性转化和增殖、转移。

ALK 重排的CRC 患者的KRAS、BRAF、EGFR和ERBB2 基因状态大部分为野生型，很少发生共同突变，这与其他RTK 重排CRC 的基因组学特征存在一致性。ALK 靶向疗法有望为该患者群体提供临床获益。由于这类重排患者较少，不利于开展临床试验，但目前发生ALK 融合的CRC 患者对ALK 靶向治疗应答已有个案报道[25]。如STRN-ALK 基因重排mCRC患者获益于ALK/ROS1 抑制剂ceritinib，另1 例CADALK 基因重排患者获益于ALK/ROS1/NRTK 抑制剂entrectinib。除了基因重排，也有报道在3.4%的CRC 患者中发现ALK 基因拷贝数增加或扩增。ALK基因拷贝数增加与患者不良预后密切相关，且患者对EGFR 单抗治疗不应答，这部分患者能否获益于ALK 抑制剂治疗，仍有待进一步深入研究。此外，ALT 基因重排也可在CRC 患者的ctDNA 中检测，为无创检测患者基因重排提供了新的途径[26]。

结肠癌中ROS1 融合报道较少，仅发现1 例SLC34A2-ROS1 融合和GOPC-ROS1 融合患者的个案报道。由于ALK 和ROS1 的激酶活性区域有70%的相似性，ALK 抑制剂有望用于ROS1 基因重排mCRC 患者的治疗[26]。

3.2 NTRK 基因重排

神经营养性酪氨酸激酶受体NTRK 基因家族有NTRK1、NTRK2、NTRK3 三个成员，分别位于染色体1q22、9q21、15q25 不同区段，对应的编码蛋白称为TRKA、TRKB 和TRKC。NTRK 基因融合是由于染色体变异，导致NTRK 基因家族成员与另一个不相关的基因发生融合[27,28]。TRK 融合蛋白处于持续激活状态，引发下游信号通路级联反应，驱动肿瘤发生。NTRK 基因融合的CRC 患者高危因素为老年女性、MSI-H、右半结肠、淋巴结转移，且RAS、BRAF 等基因状态大多为野生型。并且，在ALK、ROS1 和NTRK 基因重排的患者中，MSI-H 状态占比30%～35%甚至更多，未来期待更多的研究阐明MSI 状态和激酶基因重排相关性的分子机制。2017年美国临床肿瘤学会（ASCO）和2018年欧洲肿瘤内科学会（ESMO）年会都报道了NTRK 靶向药物larotrectinib 针对NTRK 基因融合的肿瘤患者具有较好的疗效[29]。新的Trk 抑制剂entrectinib（ALK/ROS1/NTRK 抑制剂）也正进行Ⅱ期全球临床试验。报道显示，在结直肠癌中NTRK 基因重排的比率在0.2%～2.4%之间，常见融合有TPM3-NTRK1 和LMNA-NTRK1。TPM3-NTRK1 基因融合重排最初于30年前在结肠癌中被发现，但一直未获得广泛关注。近期一项研究用TrkA 特异性抗体进行免疫组织化学、qPCR 定量检测TPM3-NTRK1 重排连接区域，在1.5%的CRC 患者中检测到TPM3-NTRK1 基因重排。NTRK1 的激活启动下游PI3K/AKT、Ras/MAPK 和PLC-γ 信号通路，TrkA小分子抑制剂NMS-P626 目前处于临床前研究，显示了很好的临床应用前景[30]。

ALK、ROS 和NTRK 基因重排的CRC 患者预后较差，对EGFR 单抗治疗原发性不应答，部分解释了EGFR 单抗在右半结肠RAS/BRAF 野生型患者中获益有限的原因。因此，对存在ALK、ROS 或NTRK 基因重排的右半结肠病变的患者，除了考虑对应的靶向治疗，一线治疗中使用强化治疗方案如FOLFOXIRI 联合贝伐珠单抗，可能也是比较合理的选择[26]。

目前融合基因检测在mCRC 患者中并非为常规分子检测，因此导致存在基因重排的患者可能被漏诊。未来检测基因重排的标准化流程有待进一步确认，如何应用简单可行的方法如免疫组化先筛选，再进一步行复杂分子检测（如qPCR、FISH 和测序等）确诊基因重排的患者，可能是性价比较高的检测方式。另一方面，由于ALK/ROS/NTRK 基因重排患者较大比例地存在MSI-H 状态，这为未来的联合治疗（针对ALK/ROS1/NTRK 的靶向治疗和免疫治疗联合）提供了更多的治疗选择[26]。

4 其他少见基因突变/融合/扩增

0.4%的CRC 患者发生有RET 基因融合，同样倾向于高龄、右半结肠、RAS/BRAF 野生型和MSIH 等患者[31]。存在RET 基因融合的mCRC 患者预后更差，平均OS 约14 个月。目前已有研究显示，多靶点抑制剂ponatinib 和vandetanib 在肠癌RET 基因融合的人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型中取得良好效果[32]。FGFR2 扩增发生在约5% 的胃癌中，目前应用NGS 测序技术也发现CRC 患者中存在FGFR 扩增，但具体比例不详，FGFR/STAT 通路是这类患者的治疗靶点。EGFR 突变在肠癌中很少发生，多发生于EGFR 单抗西妥昔继发性耐药的患者中[33-34]。经西妥昔单抗治疗后，一部分患者EGFR 胞外段发生突变（Ser492），阻止了西妥昔单抗和EGFR 胞外段的有效结合，下游激活信号通路不能被西妥昔单抗抑制，导致肿瘤发生进展。而EGFR Ser492 突变不影响帕尼单抗和EGFR 结合并对下游EGFR 通路发挥抑制作用，因此，此类突变患者换用帕尼单抗仍然能获得较好的疗效[35]。CDKs 基因扩增是癌症中最常见的改变之一，在肿瘤中的发生率为15%～40%，有研究表明在CRC 患者中也存在CDKs 扩增，但具体比例尚不明确[36]。CDKs 抑制剂通过靶向细胞周期蛋白，进而阻止肿瘤生长[37]。尽管目前在CRC 中开展的研究报道较少，但CDK4/6 抑制剂在乳腺癌中成功应用将会对包括CRC 在内的许多其他实体肿瘤的治疗产生深远影响[37]。

5 结语与展望

随着深度测序技术的发展、临床肿瘤技术的提高和新型靶向药物的不断研发，现有的分子检测标准已不能满足对于CRC 患者精细化管理的要求。虽然目前公认KRAS、NRAS 和BRAF 突变对抗EGFR 治疗反应较差，但即使是KRAS、NRAS 和BRAF 野生型患者，仍有大约40%的患者对EGFR 单抗治疗原发性不应答，表明其他致癌驱动因素可能在此类患者中发挥关键作用。目前，针对CRC 患者中HER2 扩增或过表达以及BRAF V600E 突变者，均有相应的靶向治疗方案运用于临床实践。可以预见，未来的CRC诊疗发展将对患者的分子诊断更加精细，有望识别出更多的治疗靶点，研发相应的药物。随着越来越多的临床试验和真实世界的研究出现，少见基因变异CRC 患者将有望得到更加精准的靶向治疗。