箭筈豌豆纳豆的发酵工艺

张海粟,王家林

(青岛科技大学海洋科学与生物工程学院,山东青岛266042)

纳豆,在日本有着悠久的历史,是一种由纳豆菌发酵而成的发酵食品。发酵后的纳豆具有特殊的氨味,且富含异黄酮、维生素、纳豆激酶等多种营养物质[1]。纳豆中所含的纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶,可以高效地溶解血栓,相比于临床溶栓药物,纳豆激酶具有食用安全、生产低成本、普遍适应性强、没有毒副作用、口服方便等优点[2-3]。纳豆激酶作为一种新型的溶栓药物受到越来越多的人关注,具有广阔的研究前景[4-5]。

箭筈豌豆的矿物质组成和粗蛋白含量与鹰嘴豆和小扁豆类似,且富含多酚类物质、碳水化合物、β-胡萝卜素和蛋白质等多种营养元素[6]。研究发现,箭筈豌豆提取物内的抗氧化活性高于大豆提取物,且比大豆具有更高的抗氧化和清除自由基等能力[7]。此外,箭筈豌豆提取物与大豆相比具有更高的抗菌活性[8]。本研究以箭筈豌豆为原料,对其发酵工艺进行优化,通过单因素和响应面实验,改善纳豆的风味。

1 实验部分

1.1 主要材料

箭筈豌豆,青岛科技大学生物工程实验室提供;琼脂粉,牛肉膏,蛋白胨,酵母浸粉均为生化试剂;其他药品均为分析纯。纳豆芽孢杆菌:青岛科技大学生物工程实验室保藏菌种。

液体培养基:0.5 g酵母浸粉,1 g蛋白胨,1 g氯化钠,100 mL蒸馏水,混匀,高压蒸汽灭菌。

1.2 实验方法

1.2.1 纳豆芽孢杆菌生长曲线的测定

将实验室保藏的菌株接种到液体培养基中活化。取一定量活化后的纳豆菌液,每隔2 h于分光光度计上测660 nm 处的数值。以测得的吸光度数值为纵坐标,对应的时间为横坐标,绘制纳豆芽孢杆菌的生长曲线[9]。

1.2.2 箭筈豌豆纳豆制备工艺流程

称取10 g表面圆润,无虫咬的箭筈豌豆,用水淘洗至水清为止,加入蒸馏水没过箭筈豌豆浸泡过夜。将浸泡过的箭筈豌豆多余水分倒掉,同时留适量水分,放入灭菌锅121 ℃内蒸煮20 min。煮熟的豆子先冷却至30℃左右,接种提前活化的纳豆芽孢杆菌,充分搅拌,使豌豆豆面都沾满菌液。将豆子放入恒温培养箱中发酵24 h后,置于冰箱4 ℃后熟1 d,可得到成品纳豆[10]。

1.2.3 纳豆激酶活性的测定

通过硫酸铵盐析法对纳豆进行处理,所得样品即为后续试验所用的纳豆激酶粗酶液。

本实验采用Folin-酚法测定纳豆激酶[11-12]。

1)制作酪氨酸的标准曲线。

按照表1配置溶液,空白组为0号管。混匀后,37 ℃恒温水浴15 min。将各管的吸光度在680 nm下测出,以酪氨酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线图。每组平行测定3次。

表1 酪氨酸标准曲线制作的实验溶液配置表Table 1 Table of experimental solution configuration to make the tyrosine standard curve

2)纳豆激酶酶活测定

将1 g酪蛋白溶于100.0 mL蒸馏水中混匀,提前放入37 ℃的热水中进行预热。在试管中加入待测酶液1.0 mL,在37 ℃温水中进行水浴5 min。向空白管内加入3.0 mL的10%三氯乙酸溶液并摇匀,实验管加入1.0 mL的酪蛋白溶液,同时置于37℃中水浴15 min。将3.0 mL 10%三氯乙酸溶液加入实验管,1.0 mL酪蛋白溶液加入空白管中,快速震荡使酶的作用停止。静置15 min后离心5 min。取上清液1.0 mL,加入5.0 mL 0.5 mol·L－1Na2CO3溶液和1.0 mL Folin-酚试剂,在37℃水浴中保温15 min。测吸光度以空白管调零,在680 nm处测得OD 值。计算纳豆激酶酶活。

1.2.4 单因素实验

使用控制变量法分别对浸泡时间、蒸煮时间、接种量、发酵温度、发酵时间5个影响纳豆发酵的因素进行实验,每个因素取5个水平,以得出每个因素变化对纳豆发酵和感官影响的程度大小以及方向。控制其它影响因素相同,分别只改变浸泡时间(8,12,16,20,24 h)、蒸煮时间(15,20,25,30,35 min)、接种量(1%,2%,3%,4%,5%)、发酵温度(31,34,37,40,43 ℃)、发酵时间(12,18,24,30,36 h),按照1.2.2进行箭筈豌豆纳豆发酵,计算所得纳豆激酶酶活。酶活分数为纳豆激酶酶活与最高纳豆激酶酶活的比值乘50。

1.2.5 感官评定

选取10名同学组成评价小组,对箭筈豌豆纳豆成品进行打分,以口感、颜色、拉丝效果和气味为指标,满分为50分,评分标准见表2。箭筈豌豆纳豆综合评分为酶活分数与感官评价分数相加之和。

表2 纳豆感官评价Table 2 Natto sensory evaluation

1.2.6 响应面优化实验

根据单因素实验结果选出3 种影响较大的因素:接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)作为条件,选择其中影响综合分数最大的3个水平,接种量分别为2%、3%、4%,发酵温度分别为34、37、40℃,发酵时间18、24、30 h进行3因素3水平试验,分17次实验。利用Design-Expert软件设计实验,按照Box-Behnken原理进行,制作响应面图,具体设计见表3。

表3 响应面实验设计表Table 3 Design table of response surface experiment

1.3 数据处理

利用Origin软件对数据进行处理及绘制相关图,利用Design-Expert软件对响应面数据优化处理,每组实验测定3次。

2 结果与讨论

2.1 纳豆芽孢杆菌生长曲线

将测得的660 nm 处的吸光度值与时间绘制生长曲线,结果见图1。

纳豆芽孢杆菌的生长分为4个时期,分别为:迟缓期,对数期,平稳期和衰亡期。观察图1可知,0～10 h时,该菌株处于迟缓期,生长比较缓慢;10～24 h时,菌株能够利用营养繁殖迅速,处于对数生长期,在此时期OD 值增长较快;24～28 h时,为菌株平稳期;28 h之后,菌株进入衰亡期。因此,本实验选择20 h种龄的菌株作为后续实验菌株。

图1 纳豆芽孢杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

2.2 酪氨酸标准曲线

根据测得数据,以酪氨酸浓度为横坐标,680 nm 处的吸光度为纵坐标,绘制酪氨酸标准曲线,见图2。

图2 酪氨酸标准曲线Fig.2 Tryosine standard curve

在一定条件下蛋白酶可将酪蛋白水解成一种化合物,即含酚基的氨基酸。而Folin-酚试剂在碱性条件下可与含酚基的氨基酸发生反应生成一种蓝色的化合物,可在分光光度计下测得吸光度值,根据吸光度值大小可进一步判断出酶活大小[13]。根据酪氨酸标准曲线计算出当吸光度值为1时溶液中酪氨酸的含量,即定为吸光度常数K值。由图2可知,K值为119.64。蛋白酶活力X按照公式(1)计算:

其中,A为样品吸光度,A0为空白吸光度,t为反应时间,W为酶液体积,K为吸光度常数,V为反应总体积,N为稀释倍数。

2.3 单因素实验结果

2.3.1 浸泡时间对产品品质的影响

图3为不同浸泡时间对产品品质的影响。从图3可知,随着浸泡时间增加,酶活随之增加,当浸泡时间达到20 h时,酶活力达到最大,20～24 h时,酶活力呈现降低趋势。感官评价分数分别为26.4、31.2、36.5、40.3、35.5分,在20 h达到最高。固体发酵时水分是主要影响因素之一,发酵前浸泡有助于改变初始含水量。随着浸泡时间增加,豆子体积变大,有利于纳豆芽孢杆菌进入繁殖发酵,发酵效果越好,酶活力增加;当浸泡时间过长,导致豆子含水量过多,不利于纳豆芽孢杆菌利用氧生长,进而影响到纳豆激酶的产量[14]。计算得综合分数在20 h最高,因此选择20 h作为最佳浸泡时间。

图3 不同浸泡时间对产品品质的影响Fig.3 Effect of different soaking time on product quality

2.3.2 蒸煮时间对产品品质的影响

图4为不同蒸煮时间对产品品质的影响。从图4可知,随着蒸煮时间增加,纳豆激酶的活力增加,在30 min时酶活力达到最大;感官评价分数分别为31.5、40.0、41.9、39.1、34.2 分。蒸煮时间的长短影响纳豆的口感,对结果有一定影响。随着蒸煮时间增加,豆子逐渐变软,有利于纳豆菌的生长繁殖及对营养充分利用;蒸煮时间过长,可能对豆子内部营养物质造成破坏,不利于纳豆菌利用发酵,使得纳豆激酶含量降低[15]。计算可知,综合分数在25 min最高。因此,选择25 min作为最佳蒸煮时间。

图4 不同蒸煮时间对产品品质的影响Fig.4 Effect of different cooking time on product quality

2.3.3 发酵温度对产品品质的影响

图5为不同发酵温度对纳豆产品品质的影响。从图5可知,随着发酵温度的增加,纳豆激酶活力呈现先增加后降低的趋势。纳豆激酶活力在37 ℃时达到最大,感官评价分数分别为23.1、32.9、40.1、38.2、33.8分。在适宜的温度时,纳豆菌生长繁殖快,能够充分利用营养;而温度过高时,影响了纳豆菌的生长及代谢。同时,温度对于酶活具有一定影响。一般来说,温度越高,酶的内部结构可能被破坏,越容易导致酶活降低[16]。计算可知,综合分数在37 ℃达到最高。因此,37 ℃作为最佳发酵温度。

图5 不同发酵温度对产品品质的影响Fig.5 Effect of different fermentation temperatures on product quality

2.3.4 发酵时间对产品品质的影响

图6为不同发酵时间对纳豆产品品质的影响。从图6可知,发酵时间在12～30 h时,酶活力随着发酵时间的增加逐渐增加;发酵时间超过30 h,酶活力下降。因此,酶活力在30 h时达到最大,感官评价分数分别为24.7、35.3、43.5、31.1、24.2 分。发酵时间的长短对菌株的繁殖及成品纳豆的性质都会有一定影响。发酵初期,纳豆菌代谢加快产物积累,纳豆激酶酶活较高;随着发酵时间过长,豆子内剩余的营养减少,纳豆菌代谢下降,而代谢废物逐渐积累,加上环境的影响,酶活力逐渐降低[17]。计算可知,综合分数在24 h达到最高。因此,24 h作为最佳发酵时间。

图6 不同发酵时间对产品品质的影响Fig.6 Effect of different fermentation time on product quality

2.3.5 接种量对产品品质的影响

图7为不同接种量对纳豆产品品质的影响。从图7可知,在1%～2%接种量时,随着接种量的增加,酶活力呈现上升趋势;当接种量超过2%时,酶活力开始下降,感官评价分数分别为23.5、27.6、40.1、35.8、24.4分。接种量的多少意味着发酵初始菌株量的多少,对成品纳豆性质非常重要。在一定范围内增大接种量,使得初始活菌数高,产酶量上升;而接种量过大,纳豆菌之间竞争大,豆子内营养消耗过快,细胞初级代谢旺盛,而细胞次级代谢受到抑制,导致纳豆激酶的产量下降[18]。计算可知,综合分数在3%时达到最高。因此,3%接种量作为最佳接种量。

图7 不同接种量对产品品质的影响Fig.7 Effect of different inoculum amount on product quality

2.4 响应面实验结果

根据表3的实验表,选用接种量、发酵时间、发酵温度作为因素对实验进行优化,以综合分数做指标,设计3因素3水平实验,实验结果见表4。

表4 响应面实验设计及结果Table 4 Design scheme and results of response surface experiment

根据表4数据,可得到回归方程:Y＝90.66＋0.41×A－0.28×B＋0.19×C＋0.40×A×B＋0.38×A×C－0.10×B×C－4.94×A2－2.52×B2－0.24×C2。

利用Design Expert软件对结果进行分析,结果见表5。

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表5可知,模型的P值小于0.000 1是显著的,失拟项为0.199 8＞0.05是不显著,对模型是有利的。模型具有参考性。模型的R2＝0.990 1,说明模型拟合程度较好,实验方法可行。从回归方程和方差分析表可知,A、A2、B2对响应值Y影响显著,在响应面实验里3种条件的主次关系:接种量＞发酵温度＞发酵时间;两种因素之间交互作用的影响关系:接种量和发酵温度＞接种量和发酵时间＞发酵温度和发酵时间。

图8 至图10 为各因素的响应面图和等高图。由图8、9、10可知,发酵温度和接种量、发酵时间和接种量、发酵时间和发酵温度之间存在一定的交互作用,该模型具有较好的拟合度,能够反应响应值与条件之间的关系。接种量、发酵时间、发酵温度对综合分数具有相关性,表现为曲面较陡。其中,接种量对综合分数的影响最大。结合等高图曲线的疏密程度,接种量和发酵温度的交互作用更显著。

图8 Y＝f(A,B)的响应面图和等高图Fig.8 Response surface diagram and contour map of Y＝f(A,B)

图9 Y＝f(A,C)的响应面图和等高图Fig.9 Response surface diagram and contour map of Y＝f(A,C)

图10 Y＝f(B,C)的响应面图和等高图Fig.10 Response surface diagram and contour map of Y＝f(B,C)

根据建立的模型经过预测和分析,发酵箭筈豌豆纳豆的最佳条件:3.1%接种量,36.8 ℃发酵温度,26.7 h发酵时间。在优化条件下实验验证,每次实验做3次平行。发酵完成的箭筈豌豆纳豆的酶活为314.06 U·m L－1和感官评分为40.9分,与预测值接近,且颗粒饱满,表面附有黏膜,搅拌后拉丝细长,口感略微有硬度,氨臭味较轻,适合食用。该模型是可行的。

3 结论

采用箭筈豌豆作为原材料发酵制作纳豆,通过单因素实验测定了影响发酵纳豆的5个工艺条件:浸泡时间、蒸煮时间、发酵温度、发酵时间、接种量。通过响应面优化得到最佳工艺:接种量为3.1%,发酵温度为36.8℃,发酵时间为26.7 h。在此条件下发酵完成的箭筈豌豆纳豆的酶活为314.06 U·m L－1。成品箭筈豌豆纳豆与传统纳豆相比,口感略硬,且氨味较轻有独特香味。