柱前衍生-高效液相色谱法测定婴幼儿配方 乳粉中3 种伏马毒素

陈同强，郭锦材，李 灿，王亮亮，向 俊，邹子爵，徐文泱，李凯龙

（1.食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410111；2.湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410000；3.长沙市口腔医院，湖南 长沙 410006；4.湖南省植物保护研究所，湖南 长沙 410125）

乳粉因其高营养价值受到消费者欢迎，婴幼儿配方乳粉作为很多婴幼儿的主食，其质量安全倍受关注。为了模仿母乳，婴幼儿配方乳粉中往往会添加一些其他营养成分，如脂肪酸、维生素等。

伏马毒素是镰孢菌种产生的次生代谢产物，其本身具有一定毒性，摄入人体会危害健康[1-3]。伏马毒素广泛存在于食品中，尤其对玉米及其制品等的污染最为严重[4]。 玉米油等植物油常被添加到婴幼儿配方乳粉中，以达到接近母乳成分，这样伏马毒素污染随之转移。目前，国内尚未针对食品中伏马毒素的限量做出相关规定，欧盟对伏马毒素B1（fumonisin B1，FB1）和FB2的总量已有部分规定，其中婴幼儿食品中的限量为200 μg/kg[5]。

伏马毒素常用检测方法主要包括酶联免疫法、高效液相色谱-荧光检测器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法和液相色谱-串联质谱法等[6-7]。目前关于伏马毒素检测方法的建立主要集中在饲料[8-9]、粮食及其加工品[10-18]等相对简单的样品基质，而对婴幼儿配方乳粉这类复杂基质中伏马毒素检测方法的报道较少见。本研究对现有的检测条件及前处理进行优化改进，建立HPLC法测定婴幼儿配方乳粉中3 种伏马毒素含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

网购婴幼儿配方乳粉45 份，其中国产品牌20 份，国外品牌25 份，其中0～6、6～12、12～36 月龄各15 份。

FB1、FB2、FB3标准品 美国Sigma公司；伏马毒素免疫亲和柱（柱容量≥2 500 ng，3 mL） 上海安谱实验科技股份有限公司；所用试剂均为色谱纯。

1.2 设备与仪器

LC-20A HPLC仪（配备FLD） 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液、试剂及衍生溶液配制

FB1、FB2、FB3标准储备溶液（100 μg/mL）：准确称取FB1、FB2、FB3标准品各1.0 mg于10 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，摇匀，-20 ℃下避光保存。

FB1、FB2、FB3混合标准工作液：分别准确移取FB1、FB2、FB3标准储备溶液1.0、0.5、0.5 mL于10 mL容量瓶中，空白样品提取液溶解并定容，得到FB1、FB2、FB3质量浓度分别为10.0、5.0、5.0 μg/mL的混合标准工作液，-20 ℃下避光保存。

磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）：准确称取氯化钠7.8 g、磷酸氢二钠1.0 g、磷酸二氢钾0.3 g，加水1 L，玻璃棒搅拌，待固体完全溶解后用盐酸调节pH值为7.4左右。

体积分数0.1%吐温-20-PBS：准确移取1.0 mL吐温-20，加入PBS定容至1 L，搅拌混匀。

甲醇-乙酸溶液（98∶2，V/V）：吸取2 mL乙酸，加入到98 mL甲醇中，混合均匀。

硼砂溶液（0.1 mol/L）：称取3.8 g（精确到0.01 g）硼砂于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀。

衍生溶液：准确称取邻苯二甲醛40 mg，加1 mL甲醇溶解后，先后依次加入5 mL 0.1 mol/L硼砂溶液、50 μL 2-巯基乙醇，摇匀，将溶液转移至棕色瓶中，现用现配。

1.3.2 样品前处理

称取乳粉样品4.0 g于50 mL塑料离心管中，加入20 mL体积分数50%乙腈-水溶液，振摇提取20 min，4 000 r/min离心5 min，重复提取1 次，合并上清液；取5 mL上清液，加入20 mL PBS，混匀，过滤，移取10 mL注入免疫亲和柱，待样品全部通过免疫亲和柱，弃去流出液，加入10 mL体积分数0.1%吐温-20-PBS洗柱1 次，再取10 mL水洗柱2 次，弃去流出液，加入3 mL甲醇-乙酸 溶液，收集洗脱液，移取1 mL洗脱液氮吹至近干，加入1 mL体积分数50%乙腈-水溶液复溶，过滤后待衍生。

1.3.3 衍生化反应

移取100 μL标准溶液或样品溶液于2.0 mL塑料离心管中，加入100 μL衍生溶液，涡旋混匀1 min， 5 000 r/min离心5 min，取上清液于装有内插管的样品瓶中，HPLC分析。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：反相C18柱（25 cm×4.6 mm，5.0 μm）；激发/发射波长：335 nm/440 nm；流动相A为0.10 mol/L 甲酸铵-甲酸缓冲液（pH 3.4），流动相B为甲醇；梯度洗脱条件：0.0～4.0 min，70%流动相B；6.0 min，80%流动相B；8.0 min，70%流动相B；流速1 mL/min；进样量20 μL；柱温35 ℃。

1.3.5 结果计算

待测样品中FB1、FB2、FB3含量按下式计算。

式中：X为待测样品中FB1、FB2、FB3的含量/（μg/kg）；ρ为待测液中FB1、FB2、FB3的质量浓度/（μg/L）；V为定容体积/mL；m为样品质量/g。

1.4 数据处理

数据处理及绘图采用Excel 2010软件完成。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

食品中伏马毒素的提取常采用乙腈-水溶液（50∶50，V/V）、甲醇-水溶液（75∶25，V/V）、甲醇-乙腈-水溶液（25∶25∶50，V/V）和pH 9.2的甲醇-硼酸盐缓冲液（75∶25，V/V）等作为提取溶剂[19]。采用样品加标回收的方式对上述几种提取溶剂的提取效果进行比较。由图1可知，采用乙腈-水溶液（50∶50，V/V）提取的3 种伏马毒素加标回收率均较高，优于其他几种提取溶剂，且出峰未存在明显的杂质干扰。因此，选择乙腈-水溶液（50∶50，V/V）作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对3 种伏马毒素加标回收率的影响Fig. 1 Effect of different extraction solvents on recovery of added fumonisins

2.2 流动相的选择

邻苯二甲醛溶液作为柱前衍生溶液时，常见的流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇，但实验中发现，当甲醇比例较高时会出现盐析现象，只能配制一定比例的流动相进行等度洗脱，从而导致目标峰分离效果不好，FB1和FB3出峰时间较长。为缩短分析时间，使得FB1和FB3快速出峰，同时增强FB2和FB3的检测灵敏度，采用甲酸铵-甲酸缓冲体系替代磷酸盐缓冲体系作为流动相进行梯度洗脱。本研究比较不同浓度（0.01、0.02、0.05、0.10 mol/L）的甲酸铵缓冲液（pH 3.5）对3 种伏马毒素分离效果的影响，结果显示：当甲酸铵浓度达到 0.10 mol/L左右时，3 种伏马毒素的分离效果佳且峰型较好；随着甲酸铵浓度的降低，FB1出峰处有杂质峰干扰，且峰型较差，FB2和FB3不能实现完全分离，因此，采用含0.10 mol/L甲酸铵的缓冲盐体系作为流动相中的水相部分。

2.3 流动相pH值的选择

流动相的pH值会对FB1与FB2的出峰状况及灵敏度有影响[19]。本研究比较pH值为3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0的甲酸铵-甲酸缓冲体系对FB1、FB2、FB3色谱峰分离效果的影响，结果发现：随着流动相pH值的降低，3 种伏马毒素出峰时间向后移动，导致分析时间过长；当pH值为3.4左右时，FB1、FB2、FB3达到分离要求，且峰型相对较好；随着pH值的继续降低，虽然分离效果更好，但加入到流动相中的甲酸含量将大幅增加，长期使用会严重缩短色谱柱的使用寿命，同时当pH值降至3.4以下时，会出现杂峰，对FB1的检测产生干扰。因此选择pH 3.4左右的甲酸铵-甲酸缓冲体系作为流动相的水相部分。

2.4 柱温的选择

一般来说，随着色谱柱温的升高，出峰时间将会缩短。考察不同柱温（25、30、35、40 ℃）时发现，当柱温较低时，对FB1的检测有干扰；柱温较高时，出峰过快，分离效果不佳，且容易被杂质峰干扰。因此综合考虑，柱温选择35 ℃。

2.5 基质效应

分别用流动相和空白样品提取液配制标准溶液，比较伏马毒素在不同溶剂介质中的基质效应，结果显示，伏马毒素在乳粉提取净化液中均表现出较强基质效应，因此本研究采用空白样品提取液作为溶剂配制标准溶液能较好地消除伏马毒素基质效应的影响。

2.6 方法学考察

2.6.1 标准谱图和线性关系

准确移取FB1质量浓度分别为20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/L，FB2、FB3质量浓度分别为10.0、25.0、50.0、100.0、250.0 μg/L的伏马毒素标准工作溶液100 μL，加入100 μL邻苯二甲醛衍生剂反应。在设定的色谱条件下采用HPLC-FLD分析，由图2可知，3 种伏马毒素峰型良好，分离度高，且杂峰干扰少。以峰面积为y轴，3 种伏马毒素质量浓度为x轴绘制标准曲线，结果表明，FB1在20.0～500.0 μg/L，FB2、FB3在10.0～250.0 μg/L 质量浓度范围内均具有良好线性关系，相关系数（r）均大于0.999。

2.6.2 检出限和定量限

通过将低质量浓度的标准溶液加入到阴性乳粉样品中，制备3 种伏马毒素低质量浓度的模拟阳性样品，以3 倍信噪比作为检出限，10 倍信噪比作为定量限，得出FB1、FB2、FB3检出限分别为10、5、5 μg/kg，定量限分别为30、15、15 μg/kg。

2.6.3 加标回收率及精密度

称取9 份空白乳粉样品，分别加入低、中、高（定量限、2 倍定量限、10 倍定量限）质量浓度的FB1、FB2、FB3标准溶液，加标样品图谱如图3所示。

图3 加标样品（加标量40 μg/kg）HPLC图Fig. 3 HPLC chromatogram of spiked sample (40 μg/kg)

外标法定量并计算加标回收率及相对标准偏差，由表1可知，3 种伏马毒素加标回收率较高，相对标准偏差均小于10.0%，方法重复性好，均满足检测要求，该法适用于婴幼儿配方乳粉中3 种伏马毒素的同时测定。

表1 3 种伏马毒素的加标回收率（n=6）Table 1 Recoveries of three fumonisins (n = 6)

2.7 实际样品测定

对随机网购45 份乳粉按照实验方法检测，结果显示，所有乳粉中3 种伏马毒素均未检出，这在一定程度上表明目前市面上婴幼儿配方乳粉中伏马毒素的污染情况控制较好。

3 结 论

通过对邻苯二甲醛柱前衍生-HPLC法检测条件进行优化，选用甲酸铵-甲酸缓冲体系作为水相流动相，甲醇作为有机相流动相，采用梯度洗脱程序进行检测，不但提高了检测效率而且增强了3 种伏马毒素的检测灵敏度。通过优化水相流动相的pH值及柱温，改善了3 种伏马毒素的分离效果。通过比较常用提取溶剂的提取效率，最终选择乙腈-水（50∶50，V/V）作为提取溶剂。本研究建立的方法具有灵敏度高、重复性好等优点，适用于婴幼儿配方乳粉中3 种伏马毒素的快速检测。