益肾通络方下调ADAM17介导的EGFR表达干预膜性肾病肾小管上皮细胞凋亡研究

陈素枝，李永章，杨凤文，檀 淼，宋 蕾，檀金川*

益肾通络方下调ADAM17介导的EGFR表达干预膜性肾病肾小管上皮细胞凋亡研究

陈素枝1，李永章1，杨凤文1，檀 淼2，宋 蕾3，檀金川1*

1. 河北省中医院，河北 石家庄 050011 2. 河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011 3. 天津中医药大学，天津 301617

探讨解整合素金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）介导的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）激活与膜性肾病（membranous nephropathy，MN）肾小管上皮细胞凋亡的关系及益肾通络方的干预作用。尾iv阳离子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）构建MN大鼠模型，给予益肾通络方干预4周。实验结束后观察大鼠肾脏病理变化和肾小管上皮细胞凋亡情况；采用Western blotting和qRT-PCR法检测肾组织ADAM17、肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）以及磷酸化表皮生长因子受体（phosphorylated epidermal growth factor receptor，p-EGFR）蛋白及mRNA表达情况。与对照组比较，模型组大鼠肾脏病理改变严重，肾小管上皮细胞凋亡增多（＜0.01），肾组织ADAM17、p-EGFR、HB-EGF、TNF-α蛋白及mRNA表达显著升高（＜0.01）。与模型组相比，益肾通络方组大鼠肾脏病理有所改善，肾小管细胞凋亡减少（＜0.01），肾组织ADAM17、EGFR、HB-EGF、TNF-α蛋白及mRNA表达显著降低（＜0.01）。MN大鼠肾组织ADAM17表达增多，释放活化HB-EGFR、TNF-α增多，进而激活相应受体EGFR，EGFR活化进一步诱导肾小管上皮细胞凋亡及肾脏纤维化。益肾通络方可以通过降低MN大鼠肾组织剪切酶ADAM17表达，减少HB-EGFR、TNF-α的脱落活化，从而减少EGFR激活，以达到减少肾小管上皮细胞凋亡、延缓肾脏纤维化的作用。

膜性肾病；解整合素金属蛋白酶17/表皮生长因子受体；肾小管细胞；凋亡；益肾通络方

膜性肾病（membranous nephropathy，MN）是成人肾小球肾炎最常见的病理类型之一，也是成人特发性肾病综合征的最常见原因。大量蛋白尿是MN的特征之一，疾病严重程度和预后从自发缓解到发展为严重肾病综合征以及进展至终末期肾脏病各不相同[1]。关于MN目前较多关注的是足细胞的凋亡，很少有人关注肾小管细胞损伤。本课题组前期研究发现，MN中除足细胞凋亡外，还存在大量肾小管上皮细胞的凋亡。蛋白尿是一种有充分证据证明的肾功能逐渐丧失的预测因子，被认为是肾脏损害和功能丧失的原因，是导致肾病进展的独立危险因素。细胞凋亡被认为是肾小球硬化过程中实质细胞减少的机制之一。蛋白尿对肾小管细胞的毒性作用是引起肾小管细胞凋亡、肾小管间质炎症和纤维化的主要原因[2-3]。

蛋白尿可以通过活化补体、诱导细胞因子释放、诱导小管上皮细胞自噬、激活凋亡相关途径等不同机制诱导肾小管细胞损伤[4]。解整合素金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）是释放多种膜锚定底物的主要脱落酶，主要用于释放膜表面生长因子或细胞因子，进而极大地调节细胞因子的活性以及通过细胞因子受体的信号转导[5]。研究表明，ADAM17具有促炎和促纤维化作用[6]，ADAM17剪切并释放肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF），进而反式激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR），介导肾脏损伤[5]。

益肾通络方是河北省中医院治疗MN的有效处方，疗效突出[7]，课题组前期探讨其作用机制时发现益肾通络方不仅可以抑制肾小球足细胞损伤，还可以减少肾小管上皮细胞凋亡[8-9]。故本研究将观察ADAM17介导的EGFR的激活参与肾小管上皮细胞凋亡的机制及益肾通络方的干预作用，进一步揭示益肾通络方治疗MN的作用机制，为MN的治疗提供思路和方法。

1 材料

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠50只，8周龄，体质量（180±20）g，由河北医科大学动物实验中心提供，动物许可证号SYXK（冀）2008-0026，动物合格证书编号1509116。大鼠在河北中医学院SPF级实验中心饲养，自由进食饮水。本动物实验经河北中医学院动物伦理委员会批准（批准号DWLL2020046）。

1.2 药品与试剂

益肾通络方配方颗粒购自广东一方制药有限公司，由黄芪（批号5063231）20 g、炒白术（批号505207T）15 g、党参（批号5060421）15 g、仙灵脾（批号411420T）15 g、当归（批号5061851）15 g、莪术（批号5061671）12 g、水蛭（批号504432T）9 g、地龙（批号5062171）12 g、绞股蓝（批号407347T）15 g组成，经课题组前期研究其含毛蕊异黄酮葡萄糖苷≥0.05%、黄芪甲苷≥0.12%、阿魏酸≥0.15%、甘氨酸≥6.0%、丙氨酸≥2.5%、脯氨酸≥3.0%、水蛭胺B≥0.02%、水蛭胺C≥0.04%、党参炔苷≥0.008%、肌苷≥0.37%、丹酚酸B≥2.8%、茯苓酸B≥0.01%、茯苓酸A≥0.008%；盐酸贝那普利（批号FA20150902，10 mg/片）购自深圳信立泰药业股份有限公司；阳离子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA，批号A7906）购自北京索莱宝科技有限公司；弗式不完全佐剂（批号BJ-012-0392）美国Sigma公司；山羊抗大鼠IgG抗体、FITC标记的兔抗山羊IgG抗体（批号分别为20147-1、111-095-003）购自美国KPL公司；TUNEL试剂盒（批号ab206386）、兔抗大鼠ADAM17抗体（批号ab28233）、p-EGFR抗体（批号EP774Y）、HB-EGF抗体（批号ab218019）、TNF-α抗体（批号ab205587）购自英国Abcam公司；ADAM17、EGFR、HB-EGF、TNF-α引物购自美国Invitrogen公司；TRNzol总RNA提取试剂（批号DP405-02）购自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（批号RR047B）、SYBR®Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus）ROX plus（批号RR82LR）；DL2000 DNA Marker（批号3427Q）购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.3 仪器

ND-1000型核酸定量仪、分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；BX51T-PHD-J11型显微镜（日本Olympus公司）；TP 1020型包埋机、RM2016型切片机（德国Leica公司）；涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；离心机（德国Eppendorf公司）；qRT-PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；Tanon 1600凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型的制备、分组及给药

SD大鼠适应性喂养1周，随机分为对照组12只和造模组38只，参照Border法[10]制备MN模型：1 mg C-BSA溶于0.5 mL 0.9%氯化钠溶液，并与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，分别于大鼠双前肢腋下及双腹股沟处sc 1 mL乳化液进行预免疫，隔日1次，每周3次，预免疫1周；大鼠尾iv乳化剂（16 mg/kg）进行正式免疫，隔日1次，每周3次，连续4周。对照组大鼠尾iv等体积0.9%氯化钠溶液。造模结束后随机取造模组大鼠2只行肾脏病理检查，确认造模成功。造模期间造模组大鼠死亡1只，将剩余35只造模组大鼠随机分为模型组11只、盐酸贝那普利（10 mg/kg，相当于临床等效剂量）组12只、益肾通络方（13.22 g/kg，相当于临床等效剂量）[8]组12只。各给药组ig药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续4周。

2.2 益肾通络方对MN大鼠肾组织IgG免疫沉积的影响

实验结束后，大鼠ip 10%水合氯醛麻醉，取米粒样大小的肾皮质，于2.5%戊二醛固定液中固定，梯度乙醇脱水后包埋、固化，采用超薄切片机切片（厚70 nm），加入FITC标记的兔抗山羊IgG抗体孵育，于显微镜下观察IgG荧光沉积情况并拍照。

2.3 益肾通络方对MN大鼠肾组织病理变化的影响

取各组大鼠肾皮质（2 mm×2 mm×10 mm），于10%福尔马林中固定，分别行PAS、Masson染色，于显微镜下观察肾组织病理变化。

2.4 益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡的影响

取各组大鼠肾组织，按TUNEL试剂盒说明书检测足细胞和肾小管上皮细胞凋亡情况。

2.5 益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α mRNA表达的影响

取各组大鼠部分肾皮质，按照试剂盒说明书提取总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-ACATGCTCAGGG- AACAGGTG-3’，下游引物5’-CTGACAGTCTGTC- CTCAAAACG-3’，115 bp；上游引物5’-GGC- TCCCAGTACCTACTCAAC-3’，下游引物5’-GTA- TTCTTTCTCCTCAGCACCA-3’，173 bp；上游引物5’-CACTGGTTCAGGATGGACG-3’，下游引物5’-CCCCTTTGTCAAGAAGTAGCT-3’，185 bp；上游引物5’-CCACCTCCATCACCA- CTACC-3’，下游引物5’-CAGAGCCACCAGCAC- CAT-3’，126 bp；上游引物5’-CCTTCCGT- GTTCCTACCCC-3’，下游引物5’-GCCCAGGATGC- CCTTTAGTG-3’，131 bp。

2.6 益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α蛋白表达的影响

取各组大鼠部分肾皮质，于10%中性甲醛固定液中固定，脱水、二甲苯透明后切片（厚4 μm），常规脱蜡至水，抗原修复，加入3% H2O2清除过氧化物酶活性，滴加50 μL山羊血清封闭，滴加ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α抗体孵育，滴加山羊抗大鼠IgG抗体，加入DAB染液显色，苏木素复染3 min，封片，于显微镜下观察各组大鼠肾组织ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α表达情况。

2.7 统计方法

3 结果

3.1 益肾通络方对MN大鼠肾组织IgG免疫沉积的影响

如图1所示，对照组大鼠肾小球基底膜未见IgG荧光沉积，模型组大鼠肾小球基底膜可见大量IgG荧光沉积，益肾通络方和盐酸贝那普利组肾小球基底膜可见少量IgG荧光沉积。

图1 益肾通络方对MN大鼠肾组织IgG免疫沉积的影响

3.2 益肾通络方对MN大鼠肾组织病理变化的影响

如图2所示，经PAS和Masson染色发现，对照组大鼠肾小球基底膜正常，无增厚，无钉突形成，肾小管上皮细胞无空泡变性；肾小球结构未见异常，无嗜复红蛋白沉积，未见纤维化改变。模型组大鼠肾组织小球基底膜增厚，肾小管上皮细胞可见空泡变性，肾组织大量嗜复红蛋白沉积，肾间质纤维化改变明显。益肾通络方和盐酸贝那普利组大鼠肾小球光镜下结构有不同程度减轻。

3.3 益肾通络方对MN大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

通过TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡情况，细胞核呈棕褐色为凋亡细胞。如图3和表1所示，对照组大鼠肾小管上皮未见凋亡细胞；模型组大鼠肾小管上皮可见大量凋亡细胞，肾小管上皮细胞凋亡率明显高于对照组（＜0.01）；益肾通络方和盐酸贝那普利组大鼠肾小管上皮细胞凋亡率较模型组明显降低（＜0.01）。

3.4 益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α mRNA表达的影响

如表2所示，与对照组相比，模型组大鼠肾组织、、和mRNA表达明显升高（＜0.01）；与模型组相比，各给药组肾组织、、和mRNA表达明显降低（＜0.01）。

图2 益肾通络方对MN大鼠肾组织病理变化的影响 (×400)

图3 益肾通络方对MN大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

表1 益肾通络方对MN大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响()

与对照组比较：**＜0.01；与模型组比较：##＜0.01，表2同

**< 0.01control group;##< 0.01model group, same as table 2

表2 益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α mRNA表达的影响()

3.5 益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α蛋白表达的影响

如图4所示，ADAM17在对照组大鼠肾脏近曲小管、肾小球内皮微弱表达，在模型组大鼠肾脏近端小管上皮细胞ADAM17明显增强，益肾通络方干预后ADAM17表达下降。TNF-α主要在胞质中表达，在对照组微弱表达，在模型组呈高表达，益肾通络方干预组TNF-α表达较模型组下降。肾小管上皮细胞是HB-EGF的主要来源，正常情况下HB-EGF在近曲小管少量表达；EGFR在正常肾小管上皮细胞少量表达。对照组大鼠肾小管可见少量HB-EGF、p-EGFR表达；模型组大鼠肾组织HB-EGF和p-EGFR表达较对照组明显增强，p-EGFR在肾小管细胞表达明显，HB-EGF除在近曲小管表达外，在远曲小管和集合管也有表达；各给药组HB-EGF、p-EGFR表达较模型组有不同程度减弱。

图4 益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织ADAM17、EGFR、HB-EGF和TNF-α蛋白表达的影响 (×400)

4 讨论

络脉根据其体内分布分为阳络和阴络，阴络又根据其分布的脏腑不同而进一步分为心络、肝络、肾络等。肾络因络体细窄而具有血行缓慢、易虚易滞的特点。络脉是邪气侵犯人体的途径，MN发病时邪气犯络，正邪相争产生湿浊瘀毒等病理产物留伏于肾络，络脉细小，易入难出，易积成形，日久痹阻肾络，致肾络瘀阻。本课题组从中医“络病”理论出发，结合MN的发病特点提出“邪伏肾络、肾络瘀阻”为MN的核心病机，在此病机理论指导下提出“疏通肾络”为治疗关键，创立益肾通络方。

方中黄芪、党参、炒白术健脾益气，补气升提，脾健精微得升，水湿得运，升清降浊同时利湿消肿；仙灵脾温肾阳，固肾气，肾阳得温能行其温阳化气利水之功，肾气得固能行其封藏固摄之本，使精微得固，水湿得化。绞股蓝袪浊化痰，使有形之邪得除，脾阳得振，气机得复，络脉得通。四药配伍应用，扶人体之本虚，袪留伏之浊邪。莪术、当归破血行气、逐瘀消癥，祛肾络有形之瘀滞；地龙、水蛭入络搜剔、松透病根，通经活络，络脉畅通，邪有出路。诸药合用健脾气、补肾气、袪痰邪、化瘀浊、通肾络，扶正不留邪，祛邪不伤正。本课题组前期研究证实，益肾通络方可以明显改善MN患者临床症状，减轻MN大鼠肾脏病理损伤。

ADAM在质膜上裂解多种跨膜蛋白，这一过程称为胞外域脱落。ADAM17，也称为TNF-α转化酶，是用于释放多种膜锚定底物的主要脱落酶，已有研究证实ADAM17具有促炎和促纤维化作用，表明它可能是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）进展的重要介质。ADAM17释放的膜锚定底物包括TNF-α和EGFR配体[11]，其中2种主要的底物TNF-α和HB-EGF是肾脏损害的重要介体[5]。TNF-α是一种炎性细胞因子，是肾脏损伤的主要驱动力，可促进炎症、细胞凋亡和肾小球屏障损害[12]。HB-EGF可诱导肾小球纤连蛋白的产生，介导肾小球硬化和肾间质纤维化[13]。

肾脏ADAM17激活导致促炎和促纤维化因子TNF-α、HB-EGF释放，它们的胞外域脱落与病理因素密切相关，包括炎症、间质纤维化和肾损伤[5-6]。胞外域脱落后，这些配体与受体结合，从而导致下游信号传导。HB-EGF是EGFR转录激活的关键介体，HB-EGF释放后通过自分泌或旁分泌的方式激活EGFR。另外，脱落活化的TNF-α通过与其受体TNFR结合刺激c-Src磷酸化，磷酸化的c-Src再反式激活EGFR[14]，TNF-α通路的串扰会强烈增强EGFR激活的效果，进一步加重EGFR激活诱发的损伤作用。持续性EGFR激活足以引发肾小管功能障碍和肾间质纤维化[15]（图5）。

蛋白尿是肾小管损伤的独立危险因素，肾小管细胞长时间暴露于白蛋白会导致细胞凋亡，细胞凋亡促进了纤维化进程[16]。益肾通络方是经研究证实的治疗MN疗效确切的中药组方，既往动物实验量效关系研究证实中等剂量（临床等效剂量）的益肾通络方足以达到最佳治疗效果，故本研究以益肾通络方中剂量进行进一步研究。研究发现蛋白尿促进了肾小管细胞凋亡的发生，同时肾组织ADAM17活性增加，进而脱落释放的TNF-α、HB-EGF增多，活化的TNF-α、HB-EGF进一步激活EGFR，EGFR被持续激活，进一步触发促炎和促纤维化因子的合成和释放，导致细胞损伤、凋亡和纤维化。近端小管细胞中EGFR的持续活化是CKD进行性肾脏纤维化的标志，ADAM17从受损的近端小管细胞中释放活性可溶性EGFR配体胞外域，EGFR配体通过诱导近端小管中EGFR的重新激活来诱导持续的EGFR激活[17]。与以往研究相似[18]，有肾小管间质纤维化的梗阻性肾病、慢性肾小球肾炎和糖尿病肾病患者肾小管和间质ADAM17表达显著增加，EGFR活化的增加，并且所有患者肾组织样本中纤维化标志物的表达量与ADAM17呈显著正相关。益肾通络方干预后肾小管细胞凋亡减少，肾脏纤维化减轻，同时ADAM17及其底物TNF-α、HB-EGF表达减少，并且p-EGFR也相应下降，表明益肾通络方对肾小管细胞凋亡的干预作用可能与抑制上述信号分子有关。

图5 ADAM17介导EGFR激活诱导肾小管细胞凋亡

本研究表明，ADAM17通过EGFR信号传导途径在纤维化和炎性肾脏疾病中具有重要作用，并证实了EGFR配体HB-EGF和TNF-α对EGFR激活的重要意义。ADAM17介导的HB-EGF/TNF-α-EGFR途径共同作用以介导损伤后的肾纤维化，并确定ADAM17及其依赖性途径是预防或治疗CKD肾纤维化的可能新靶标。保护肾小管细胞免受蛋白尿相关的细胞毒性可能是对其他疗法抵抗的肾病患者的下一个治疗靶点。强调CKD中关注足细胞损伤同时也要注意肾小管细胞损伤，保护足细胞和肾小管细胞两者结合可能使患者有更大的获益。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Yishen Tongluo interferes with renal tubular epithelial cell apoptosis in membranous nephropathy by down-regulating ADAM17-mediated EGFR expression

CHEN Su-zhi1, LI Yong-zhang1, YANG Feng-wen1, TAN Miao2, SONG Lei3, TAN Jin-chuan1

1. Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China 2. The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China 3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To explore the relationship between a disintegrin and metalloproteinase 17 (ADAM17)-mediated epidermal growth factor receptor (EGFR) activation and membranous nephropathy (MN) renal tubular epithelial cell apoptosis and the intervention effect of Yishen Tongluo Recipe (益肾通络方).MN rats model was constructed by tail iv cationic bovine serum albumin (C-BSA), Yishen Tongluo Recipe was given for 4 weeks. After the experiment, the pathological changes of kidney and apoptosis of renal tubular epithelial cells in rats were observed. Western blotting and qRT-PCR were used to detect protein and mRNA expressions of ADAM17, heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and phosphorylation epidermal growth factor receptor (p-EGFR).Compared with control group, the pathological changes in kidneys of rats in model group were severe, the apoptosis of renal tubular epithelial cells were increased (< 0.01), protein and mRNA expressions of ADAM17, p-EGFR, HB-EGF and TNF-α in renal tissue were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, the kidney pathology of rats was improved after the intervention of Yishen Tongluo Recipe, the apoptosis of renal tubular cells was reduced (< 0.01), protein and mRNA expressions of ADAM17, p-EGFR, HB-EGF and TNF-α were decreased in renal tissue (< 0.01).ADAM17 expression in kidney tissue of MN rats is increased, and more HB-EGFR and TNF-α are released and activated, then activate the corresponding receptor EGFR, the activated EGFR further induce apoptosis of renal tubular epithelial cells and renal fibrosis. Yishen Tongluo Recipe can reduce the shedding and activation of HB-EGFR and TNF-α by reducing the expression of cleaving enzyme ADAM17 in kidney tissue of MN rats, thereby reducing the activation of EGFR, so as to reduce the apoptosis of renal tubular epithelial cells and delay renal fibrosis.

membranous nephropathy; ADAM17/EGFR; renal tubular cells; apoptosis; Yishen Tongluo Recipe

R285.5

A

0253 - 2670(2021)24 - 7520 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.014

2021-04-08

河北省自然科学基金青年项目（H2020423049）；河北省中医药管理局科研计划项目（2021008）

陈素枝（1989—），女，主治医师，医学博士，从事中西医治疗慢性肾脏病的研究。Tel: 18830657300 E-mail: 781506436@qq.com

檀金川（1964—），主任医师，医学博士，从事中西医治疗慢性肾脏病的研究。Tel: 13831187910 E-mail: 781506436@qq.com

[责任编辑 李亚楠]