砷及其代谢产物对A549 细胞cIAP1、cIAP2 和XIAP基因的影响

陈 倩，成会荣，黄 皓，杨 娇，冯婉君，文卫华*

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理 671000；2. 云南省疾病预防控制中心，昆明 650022）

砷（As）是一种环境性污染物，主要存在于水体及食物链中。随着工业、农业的快速发展，砷主要通过开采和冶炼含砷矿物、半导体、除草剂等释放到人类生活环境中，对全球约1.5 亿人的健康构成严重威胁〔1〕。流行病学调查显示，长期砷暴露可导致多种疾病发生，如皮肤癌、肺癌、膀胱癌和肝癌，以及认知缺陷、心血管疾病、高血压及糖尿病等〔2〕。流行病学将砷归为危害人类健康的因素之一〔3〕。

许多研究发现，细胞凋亡的失调和/ 或细胞的异常增殖在各种恶性肿瘤的发生和发展中起着关键作用〔4〕。低剂量的亚砷酸钠（NaAsO2）能激活细胞外调节激酶（ERKs）信号通路，从而抑制p53 的激活，使人角质细胞的凋亡受到抑制，从而发生癌变〔5〕。NaAsO2使肝细胞miR－155 表达水平增加，降低靶基因QKI 的水平，进而诱导细胞异常增殖，从而使肝细胞发生恶性转化〔6〕。

细胞凋亡的发生和发展直接受到细胞内部基因的影响，这些基因分为促凋亡基因（如：p53、Bax 等）和抗凋亡基因（如：Bcl－2、mcl－l 和IAPS 家族等）〔7〕。IAPS 是迄今唯一发现的内源性caspase抑制剂家族，通过与caspase 结合，抑制其活性，阻止凋亡的发生、发展〔8〕。IAPS 家族中包含细胞凋亡抑制蛋白1（cellular IAP1，cIAP1）、细胞凋亡抑制蛋白2（cellular IAP2，cIAP2）和X 染色体连锁凋亡抑制蛋白（X-linked IAP，XIAP）等〔9〕。cIAP1 和cIAP2 通过直接与caspase－3 和caspase－7 结合，从而达到抑制二者的活性，最终达到抑制细胞凋亡的作用。XIAP 是IAPS 家族中最强抑制蛋白，直接抑制凋亡途径的起始阶段及持续阶段〔10〕。

通常来说，促细胞凋亡因子和抗细胞凋亡因子之间的平衡是决定细胞是否发生凋亡的关键〔11〕。当细胞受到砷的刺激后，促细胞凋亡因子和抗细胞凋亡因子之间的这种平衡被打破，导致细胞异常增殖，最后变成恶性细胞〔12〕。本研究探索了砷刺激作用 下，cIAP1、cIAP2 和XIAP 3 种 抗 凋 亡 基 因 的mRNA 表达情况，以此探索砷如何通过介导细胞凋亡参与肿瘤发生及发展过程。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 CO2恒温培养箱（Termo Forma 公司）；Fresco－17 型台式高速低温离心机（Termo Scientific 公司）；罗氏7900T 实时荧光定量PCR 仪；FastStart Universal SYBR Green Master 荧光定量试剂盒（上海罗氏诊断产品有限公司）；Western bolt 装置（Media Cybernetics）；人肺癌细胞（A549 细胞，中国科学院细胞库）；RPMI-1640 培养基（Corning公司）；胎牛血清（FBS，上海康晟生物科技有限公司）；青链霉素混合液（北京华越洋生物科技有限公司）；NaAsO2（纯度≥95.0%，成都西亚试剂有限公司）；甲基胂酸（MMA，纯度≥99%，AccuStandard 公司）；二甲次胂酸（DMA，纯度≥99%，AccuStandard公司）；GreenNucTM活细胞Caspase－3 活性检测试剂盒、胰蛋白酶和CCK-8 试剂盒均购于碧云天生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与传代 将A549 细胞接种于T25培养瓶中，用RPMI-1640 完全培养基（含10% FBS和1%青链霉素混合液）置于37 ℃、5 % CO2恒温培养箱中培养。每2 d 更换1 次新鲜培养基，待细胞密度达到70%～80%时，用胰蛋白酶消化后进行传代。

1.2.2 细胞活力检测 取对数生长期细胞，以8000 个/孔的细胞密度接种于96 孔板中，接种22 h后，参考文献〔13〕，选择浓度为0、20、40、50、60、80、100 μmol/L NaAsO2和60 μmol/L MMA、60 μmol/L DMA 进行A549 细胞染毒处理，染毒48 h后每孔加入10 μL CCK-8 试剂，于酶标仪（450 nm）检测各组OD 值以判断细胞活力变化并选择后续染毒剂量。

1.2.3 细胞分组与处理 取处于对数生长期的A549 细胞，以2.5 × 105个/孔的细胞密度接种于6孔板中。基于细胞活力检测结果，22 h 后分别以浓度 为0、20、40、60 μmol/L NaAsO2和60 μmol/L MMA、60 μmol/L DMA 染毒。

1.2.4 细胞凋亡与坏死检测 取处于对数生长期的A549 细胞，以8000 个/孔的细胞密度接种于96孔板中，参照“1.2.3”项NaAsO2的浓度对A549 细胞进行染毒。染毒48 h 后弃去原培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗1 次，用含5 μmol/L 新鲜培养基的GreenNucTM活细胞Caspase－3 活性检测试剂盒对细胞进行染色，室温避光孵育30 min，再用PBS 清洗1 次，加入50 μL PBS 于荧光显微镜下拍摄每组细胞情况，其凋亡细胞的细胞核呈亮绿色。

1.2.5 细胞中总RNA 提取 收集砷及其代谢产物处理48 h 后的细胞，丢弃原培养基，并用PBS 轻柔洗细胞1 次，每孔加入1 mL Trizol 提取细胞总RNA，采用核酸蛋白测定仪检测OD260/OD280（在260 nm 和280nm 吸光度比值），并利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。

1.2.6 mRNA 表达水平的检测 经实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测各处理组cIAP1、cIAP2和XIAP mRNA 表达水平，以GAPDH 为内参基因，采用2－ΔΔCt表示mRNA 表达水平。同一浓度设3 个重复试验孔，引物序列见表1。

表1 cIAP1、cIAP2、XIAP 和GAPDH 引物序列

1.2.7 统计学分析 采用SPSS 24.0 统计软件进行数据录入，实验数据用（±s）描述，多组间比较采用单因素方差分析（One－Way ANOVA）。方差不齐时，采用Games－Howell 检验；方差齐时，采用SNK 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活力检测 随着NaAsO2染毒浓度的递增，细胞活力逐渐下降，见图1A。半致死浓度（LC50） 为63.4 μmol/L，包含在所选定的实验剂量内，见图1B。砷代谢产物MMA、DMA 也使细胞活力呈下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），见图1C。

图1 细胞活力检测结果

2.2 细胞凋亡与坏死检测 利用GreenNucTM活细胞Caspase-3 活性检测试剂盒对细胞凋亡和坏死情况进行检测，凋亡细胞的细胞核呈现亮绿色。结果显示，在未加入NaAsO2的细胞中未出现明显绿色亮点；加入20 μmol/L NaAsO2，细胞中出现3 个绿色亮点；加入40 μmol/L NaAsO2，细胞中出现6 个绿色亮点；加入60 μmol/L NaAsO2，细胞中出现21个绿色亮点。经MMA 处理的细胞出现了2 个绿色亮点，而经DMA 处理的细胞中绿色亮点不明显。结果表明，随NaAsO2浓度的增加，细胞凋亡和坏死比例逐渐增多；MMA 和DMA 处理后细胞也有少量凋亡坏死，但经MMA 处理的细胞凋亡坏死数量多于DMA 处理的细胞。

2.3 不同剂量NaAsO2染毒A549 细胞对cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表达影响 不同浓度NaAsO2染毒A549 细胞cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表达水平与对照组（0 μmol/L NaAsO2）比较明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05），并存在显著剂量依赖关系。见图2。

图2 NaAsO2 对cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表达影响

2.4 MMA、DMA 染毒A549 细胞对cIAP1、cIAP2和XIAP mRNA 表达影响 MMA 染毒A549 细胞cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表达水平与对照组（0 μmol/L NaAsO2）比较明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）。 DMA 染毒A549 细胞cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表达水平与对照组（0 μmol/L NaAsO2）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3 MMA、DMA 对cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 表达影响

3 讨论

砷是一种广泛存在于自然界的微量元素，其代谢产物MMA 和DMA 极易溶于水。无机砷是国际癌症中心确认的人类A 类致癌物〔14〕，长期砷暴露可能导致膀胱癌、肺癌和肝癌等发生。目前砷致癌的机制尚不明确，就目前的研究分析来看，可能与氧化应激、DNA 损伤、染色体异常和表观遗传变化等有关。有研究发现NaAsO2通过诱导miR－145 的过度表达，促进DNA 损伤，从而诱发肝细胞癌〔15〕。

Li 等〔16〕指出肿瘤细胞具有十大标志性指标，其中之一是抑制细胞的凋亡。而细胞凋亡是一种维持内环境稳态的自主程序性死亡过程，即细胞程序性死亡〔17〕，其过程为细胞发生核皱缩，染色质固缩，DNA 降解，形成凋亡小体，被周围的吞噬细胞识别和吞噬〔18〕。正常细胞处于增殖与凋亡的动态平衡中，细胞通过凋亡清理处于过度增殖、具有过度增殖趋势或具有潜在危险的细胞，避免机体自身的细胞转化为威胁内环境平衡的恶性细胞，而当细胞凋亡受到抑制时会促进肿瘤的发生发展〔19〕。

研究表明，癌细胞中存在过量表达的cIAP1、cIAP2 和XIAP〔20〕。cIAP1、cIAP2 和XIAP 是重要的抗凋亡因子，当在细胞中过量表达时，细胞的凋亡受到抑制，细胞的增殖与凋亡之间的动态平衡被打破，使细胞过度增殖，从而发生癌变，在细胞癌变过程中起到重要作用。有研究表明，NaAsO2通过抑制细胞凋亡途径来抑制细胞的正常凋亡，致使细胞发生恶性转化。XIAP 是最强的内源性caspase 抑制剂，可以通过直接结合caspase，激活NF－кB 信号通路与其他信号通路等，抵抗细胞凋亡的发生〔21〕。而cIAP1 和cIAP2 的C－末端携带具有E3 泛素连接酶功能的RING 结构域，通过泛素蛋白酶体途径降解目标蛋白来发挥抑制细胞凋亡的作用〔22〕。

本研究结果显示，A549 细胞的cIAP1、cIAP2 和XIAP 基因在不同浓度NaAsO2下的mRNA 表达量与对照组（0 μmol/L NaAsO2）相比均下降。相关文献表明，砷暴露可以使抗凋亡基因的表达下降〔23〕，本研究发现NaAsO2染毒后的A549 细胞cIAP1、cIAP2和XIAP 基因的mRNA 表达水平下降，与Zhao 等〔24〕研究结果一致。根据细胞凋亡途径和实验结果，可以推断NaAsO2染毒后的A549 细胞cIAP1、cIAP2和XIAP 基因的mRNA 表达下降，可能是因为A549 细胞受到砷的刺激，产生了过量的活性氧（ROS），使NF－кB 的表达显著下调，进一步使cIAP1、cIAP2 和XIAP 表达下降；也可能是过量的ROS 生成，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和蛋白激酶B （Akt） 的活性，从而使抗凋亡基因cIAP1、cIAP2 和XIAP 低表达。对这3 种基因来说，MMA 处理后的A549 细胞同对照组（0 μmol/L NaAsO2）相比，mRNA 的表达均下降，而DMA 处理的A549 细胞对这3 种基因mRNA 的表达无显著影响，与Tan 等〔25〕关于砷的研究结果一致。MMA 是砷代谢的中间产物，砷进入体内后生成亚砷酸，亚砷酸经过酶的一系列反应生成MMA，但MMA 却不容易转变成DMA〔26〕，所以MMA 能降低这3 种基因的mRNA 表达，而DMA 对这3 种基因的mRNA表达无显著影响。因为DMA 是砷代谢的最终产物，砷代谢的过程也是解毒过程，它的毒性远远低于无机砷〔27〕。

本研究首次探索了在不同浓度NaAsO2染毒下A549 细胞cIAP1、cIAP2 和XIAP mRNA 的表达情况，结果表明，无机砷可以抑制cIAP1、cIAP2 和XIAP 基因mRNA 的表达。本研究有利于进一步研究砷诱导细胞凋亡的作用机制，为砷致癌的作用机制研究提供实验依据。但是本研究存在一定的局限性，缺少流行病学数据，没有人群中的相关分析，只研究了砷染毒下A549 细胞mRNA 的表达，但是单个细胞对砷的代谢是有限的，而砷在人体内的毒性作用是多细胞参与共同作用的结果，因此砷在人体内的作用机制及过程还需要更深一步的研究。