登革病毒IgG抗体的检测：基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法

刘金月，李晓霞，王海鹰，唐时幸，万成松

南方医科大学公共卫生学院，广东 广州 510515

登革病毒（DENⅤ）引发的登革热（DF）是全球重大虫媒传染病，在热带、亚热带地区均有流行。随着气候变化和人口流动增多，登革热日益严重［1,2］。据统计，DENⅤ原发性感染大部分为隐性感染［3］，可作为传染源导致更多感染发生［4］。目前，DENⅤ存在四种血清型（DENⅤ1-4），单一血清型的原发感染能产生该特定血清型持久的同型免疫，但对其他血清型只能产生短暂的免疫保护［5］。研究表明，DENⅤ二次异型感染更易引发重症，包括致死性登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）等［6,7］，给疾病防控带来沉重的医疗负担［8］。另一方面，猩猩、猴类等动物对登革病毒易感，是丛林型登革热的主要传染源，可通过蚊媒感染人。因此，建立准确、便捷的DENⅤ检测技术，能提升DENⅤ现场或野外监测站点的检测能力，便于开展岛礁、边防、丛林等特殊哨点的DENⅤ早期筛查、流行病学调查。

DENⅤ实验室检验方法有病毒分离、RT-PCR、抗体检测等，病毒分离法操作繁多、费时；RT-PCR检测核酸，快速、准确、便捷，但不反映抗体水平；抗体检测是目前最常用的快速检测技术［10］。通过抗体检测，DENⅤ原发感染发病后8～10 d，可检测到IgG抗体［11］，并在体内维持多年［12］，二次感染时迅速增多［13］，已作为区分原发感染和继发感染的指标。但辣根过氧化物酶联免疫法测量光密度（OD值），检测范围较窄；特殊动物检测所需的种属二抗难获取，应用范围受限；抗原制备、蛋白表达、纯化折叠复杂，制备周期较长。

本研究采用G蛋白捕获血清中IgG抗体，Nanoluc荧光素酶与DENⅤ特异性抗原融合表达蛋白为检测抗原，检测DENⅤIgG特异性抗体，建立基于DENⅤE蛋白的荧光素酶免疫吸附法（DENⅤ-LISA）［14］，具有特异、快速、灵敏、不需要种属二抗等特点，为人群中DENⅤ感染的筛查、预警与自然疫源地病原微生物大规模监测、风险评估提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 细胞、试剂与样本

DENⅤ1（GenBank：ΚM204119.1），DENⅤ2（GenBank：ΚU094070.1）。293T 细胞为本实验室保存。大肠杆菌DH5ɑ（北京天根生物科技），荧光素酶表达载体pNLF1-N和发光底物（Promega），病毒RNA提取试剂盒（Qiagen），质粒提取试剂盒（广州美基生物科技），脂质体核酸转染试剂（上海翊圣生物科技），G蛋白（金斯瑞生物科技），商用DENⅤIgG 检测试剂盒（ELISA）（中山生物）。登革病人血清样本由本实验室、广东省疾病预防控制中心提供，正常人血清样本由南方医院提供。

1.2 构建pNLF1-E1、pNLF1-E2荧光素酶表达载体

根据DENⅤE基因核苷酸序列［15,16］，设计引物（表1），并在5'端引入EcoR Ⅰ酶切位点（斜体加粗），3'端引入XbaⅠ酶切位点（斜体加粗）和蛋白标签（下划线），交由生工生物工程（上海）合成。提取病毒RNA，逆转录为cDNA，扩增DENⅤ1-E1、DENⅤ2-E2基因片段，纯化、回收；经双酶切，连接至pNLF1-N载体，并转化至DH5α感受态细胞。将阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，对测序正确的菌株经37 ℃振荡培养16 h，提取pNLF1-E1、pNLF1-E2重组质粒。

表1 扩增DENⅤ1-E1、DENⅤ2-E2的引物序列及位置Tab.1 Primer sequences and locations of the coding sequences of DENV1-E1 and DENV2-E2

1.3 转染、获取NLu-E1、NLu-E2融合蛋白

将293T细胞无抗生素培养24 h，转染pNLF1-E1、pNLF1-E2重组质粒至293T细胞中，8 h后更换维持培养基。培养48 h，裂解细胞，经4 ℃、13 000g离心10 min，保存细胞裂解上清液。

1.4 Western blot检测NLu-E1、NLu-E2融合蛋白表达

将上述细胞裂解上清液加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，置于100 ℃金属浴，加热10 min，使蛋白变性。按照等蛋白质量上样，进行SDS-PAGE电泳，使用半干转膜法，转印至0.45 μm NC膜，使用抗蛋白标签鼠单克隆抗体作为一抗（1∶5000稀释），HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗（1∶10 000稀释），进行ECL检测。

1.5 建立DENⅤ-LISA检测

使用G蛋白，按照每孔100 μL，包被96孔白色酶标板，4 ℃孵育12 h；5%脱脂奶粉（0.05%PBST稀释）37 ℃封闭2 h；0.05%PBST洗板1次，2%脱脂奶粉稀释待测样品，每孔加样95 μL，37 ℃孵育2 h；洗板3 次，将NLu-E1与NLu-E2细胞裂解液等量混匀，按照1∶200稀释，每孔加样50 μL，37 ℃孵育45 min；弃液，洗板3次，加入荧光素酶发光底物，使用酶标仪读取相对荧光值（RFI）。以经两种检测方法检测为阳性的样本为阳性对照，以正常人样本为阴性对照，2%脱脂奶粉为空白对照。根据RFI判断血清样品中是否存在特异性抗体，将20份正常人血清样品RFI均值的二倍定义Cut-off值，样品RFI大于该值即判断为阳性。

1.6 特异性、灵敏度及稳定性评价

检测68份DENⅤ感染的病人血清样本、20份正常人血清样本与9份基孔肯雅病毒（CHIΚⅤ）感染的病人血清样本，计算DENⅤ-LISA的阳性检出率及特异度。分别使用DENⅤ-LISA 和商用检测试剂盒，对DENⅤIgG阳性血清样本和正常人血清样本进行梯度稀释，同时比较两种方法的灵敏度。使用同一批次3张酶标板做重复性试验，每次试验每个样品做3个复孔，分别分析板间、板内RFI 差异，计算变异系数，评价DENⅤ-LISA的稳定性。

2 结果

2.1 DENⅤ-LISA的建立

挑取DH5α/pNLF1-E1/E2 阳性菌落进行PCR，1.3%琼脂糖凝胶电泳，可见单一特异条带，与预计的DENⅤ1-E1与DENⅤ2-E2片段大小相似，测序结果与预期一致；Western blot结果显示，在预计蛋白相对分子质量处，pNLF1-E1/E2转染组标签蛋白有特异印迹反应，pNLF1-N 空载体转染组与空白对照组无显色条带，提示NLu-E1 与NLu-E2 融合蛋白表达成功。建立DENⅤ-LISA 技术，在1∶400 稀释度下，DENⅤIgG 阳性样本的RFI 明显高于正常人样本，表明DENⅤ-LISA建立成功（图1）。计算正常人血清样本RFI的算术均数，其二倍为31 405，取整，定义Cut-off 值为30 000。

图1 DENⅤ1-LISA的建立Fig.1 Establishment of DENV1-LISA.A:Identification of clone DH5α/pNLF1-E1/E2.Lane 1:PCR product of E1 from DH5α/pNLF1-E1;Lane 2:PCR product of E2 from DH5α/pNLF1-E2.B:Western blotting for identification of NLu-E1 fusion protein.1:pNLF1-E1;p:pNLF1-N;c:Blank control.C:Western blotting for identification of NLu-E2 fusion protein.2:pNLF1-E2;p:pNLF1-N;c:Blank control.D:DENV-LISA.

2.2 特异性评价

共检测97份血清样本，DENⅤ-LISA阳性检出率32.4%，特异度100%，CHIΚⅤ假阳性率11.1%；商用ELISA检测试剂盒阳性检出率35.3%，特异度100%，假阳性率0（表2）。经χ2检验，两种方法阳性检出率差异无统计学意义（P＞0.05）；Kappa系数0.47（P＜0.01）。

表2 特异性试验Tab.2 Specificity test of the assay

2.3 灵敏度评价

DENⅤ-LISA与商用ELISA试剂盒灵敏度试验结果显示，DENⅤ-LISA中，稀释6400倍时可以判断阳性，其中1号样本在12 800倍稀释时仍可判断为阳性；商用ELISA检测试剂盒按照说明书设定的判断标准，在稀释1600倍时已无法判断阳性样本（图2）。

图2 灵敏度试验Fig.2 Sensitivity test of DENV-LISA.A:DENV-LISA;B:Commercial ELISA.

2.4 稳定性评价

DENⅤ-LISA 3次重复性试验结果如表3所示。板内变异系数0.46%～4.69%，板间变异系数3.66%～9.37%，同批板间、板内变异系数均低于10%；经方差分析，板间、板内RFI差异无统计学意义（P＞0.05），提示该方法检测效果稳定、重复性良好。

表3 DENⅤ-LISA重复性试验Tab.3 Repeatability test of DENV-LISA

3 讨论

DENⅤ继发性感染可引发严重的DHF/DSS。研究表明，DENⅤ突变可能改变了DENⅤ的抗原性，患者再次暴露时，获得的免疫失去保护作用［17］；患者的流动能造成非流行区的本地传播，当患者来自其他国家或隐性感染时，传播风险更大［18,19］。检测DENⅤIgG抗体能有效区分初次感染和继发感染［20］，如果IgG抗体滴度在患者发病1周内迅速增高，提示患者可能为继发感染，作为登革热重症预警指征［5］；为保证接种的安全性和有效性，DENⅤ疫苗接种前应检测血清抗体［21］。因此，建立DENⅤ-LISA用于人群中DENⅤIgG抗体水平筛查，可及时发现隐性感染患者，避免疫情跨区域传播，降低DHF/DSS发生概率。

本研究采用的Nanoluc荧光素酶在底物催化下发出荧光，相较于传统辣根过氧化物酶（HRP），光强度高、衰减速度慢，适用于开发新的酶免疫吸附检测系统［22,23］。G蛋白能结合人和动物的IgG抗体，因此，DENⅤ-LISA没有种属特异性，不需要动物源性二抗，使检测应用范围更广泛。

目前，DENⅤ血清学抗体检测主要针对E蛋白特异性抗体，但是抗体检测不可避免存在交叉反应［24］；此外，CHIΚⅤ感染临床症状与DENⅤ感染类似，这给抗体检测增加了难度，要求检测抗原具备更高特异性［25］。

商品化DENⅤIgG ELISA试剂盒多为C6/36细胞培养病毒获取检测抗原，或利用原核表达系统制备检测抗原。而本研究利用基因工程技术及真核表达系统，获取NLu-E1与NLu-E2融合蛋白作为检测抗原，既避免培养病毒，又保留天然表位，降低抗原制备的危险性与难度，制备时间短，成本低［26］。本研究还发现，以NLu-E1作为检测抗原，阳性检出率10.3%，特异度96.6%；以NLu-E2 作为检测抗原，阳性检出率29.4%，特异度89.7%；以NLu-E1/E2 作为检测抗原，阳性检出率32.4%，特异度96.6%。结果显示，NLu-E1与NLu-E2存在不同的抗原表位，并且组合使用，增加了阳性检出率和检测特异性［27］。NLu-E1、NLu-E2分别作为检测抗原，阳性检出率差异有统计学意义（P＜0.05），可能因为E蛋白第一、第三区域存在型特异性表位［28］。全类型检测试剂盒使用DENⅤ1-4混合抗原，本研究使用DENⅤ1与DENⅤ2混合抗原，阳性检出率（32.4%）与全类型检测试剂盒（35.3%）差异无统计学意义。可能因为血清样本来自广东省，患者主要感染DENⅤ1或DENⅤ2［29］，与本研究使用检测抗原来源一致。DENⅤ全类型检测增加了IgG抗体结合位点，但由于存在空间位阻效应，可能会影响抗原与抗体的特异性结合［24］。

本研究正常人血清样本中未检出阳性，CHIΚⅤ患者样本假阳性率11.1%（1/9），假阳性率较低［30］，特异度高，优于部分检测试剂盒。登革热患者血清样本IgG抗体阳性检出率32.4%，与商用检测试剂盒持平，但总体偏低，可能是部分患者采血时处于病程早期，体内尚未产生足量E蛋白特异性IgG抗体［31］。

采用DENⅤ-LISA技术，样品稀释12 800倍时，仍可检出阳性，灵敏度高于商用检测试剂盒，可以更早地检测出患者体内IgG抗体。由于样品数量有限，且缺乏流行病学资料，灵敏度与阳性检出率之间的关联，有待更多临床样本，做进一步验证。

DENⅤ-LISA重复性试验显示，同批板间、板内RFI变异系数均小于10%，低于检测试剂盒规定的15%，重复性好；检测抗原置于-20 ℃，保存6个月，阳性检出率和特异度没有变化。由于检测抗原直接取细胞裂解上清液，裂解液中加入甘油，可防止冰晶形成，以延长保存时间，并保持活性［32,33］。

综上所述，本研究使用DENⅤE蛋白两段特异性序列编码的融合蛋白，作为检测抗原，检测登革病毒IgG抗体，建立DENⅤ新型荧光素酶免疫吸附检测技术，特异性好，灵敏度高，重复性强，制备简便，成本低，可应用于登革热的流行病学调查、自然疫源地病原微生物的早期筛查、监测预警、跨种传播、溯源和传染病疫情风险评估等。