CRISPR/Cas9 基因组编辑技术及其在作物遗传改良中的应用进展

王莹婕，马玲玲，梁 振

（山西大学生命科学学院，山西太原 030006）

随着人口的快速增长，人们对于粮食作物的需求大大增加，然而传统作物育种方法需要进行杂交、筛选，步骤繁琐，耗时过长且效率低下，严重地限制了育种的速度，基因编辑技术的发展改变了这一现状。基因编辑技术因其可编程性倍受青睐，从锌指核酸酶（Zinc finder nucleases，ZFNs）技术到类转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技术，再到突破性的规律成簇的间隔短回文重复及其相关蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/associated protein，CRISPR/Cas9）系统，基因编辑水平日益成熟。基因编辑技术是利用人工设计的核酸酶对基因组定点修饰[1]，其修饰手段包括基因敲除/入、单碱基编辑、引导编辑等。近年来，基因编辑技术飞速发展。目前常用于基因组编辑的CRISPR 系统基于RNA 的引导来实现对DNA 的切割[2]，几经改进，已能够以“核苷酸水平”的精度在大多数生物中进行精确的修饰，因而具有更加广泛的适用性。通过基因编辑技术合成变异能够填补并在某些情况下取代自然遗传变异，对目的基因进行高效、精准的修饰，极大地缩短了植物育种时间，提高了植物育种的效率。

笔者介绍了CRISPR/Cas9 基因组编辑及其衍生技术的发展历程和工作原理，综述了多种基因组编辑工具在不同作物育种上的应用发展，同时也探讨了CRISPR/Cas9 系统目前的一些局限性和未来对于基因编辑作物的展望，以期能为作物改良领域的研究者们提供一些参考，促进作物育种的发展。

1 基于CRISPR/Cas 免疫系统的基因编辑技术

1.1 CRISPR/Cas 免疫系统的发现

CRISPR/Cas 系统来源于细菌和古细菌，是为抵御噬菌体病毒和外源质粒DNA 入侵的一种适应性免疫系统。1987 年，ISHINO 等[3]研究发现，大肠杆菌的DNA 序列中有许多片段存在规律性重复，但未对其进行详细研究。20 世纪90 年代，MOJICA 教授在海滩发现一种古细菌，分析其DNA 序列时，也发现其有类似规律重复序列，命名为CRISPR。2003 年，MOJICA 教授发现，规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）与CRISPR 关联基因（CRISPR asso ciated，Cas）一起构成的原核适应性免疫系统能够根据间隔序列的记录，准确识别这些进化历史上曾侵入过的噬菌体的特定序列，然后予以靶向的切割[4]。

CRISPR/Cas 系统由CRISPR 序列与Cas 基因家族组成。CRISPR 是原核生物基因组内的一段重复序列，由前导序列（leader）、高度保守的重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成。前导序列位于CRISPR 基座上游，富含AT 碱基，被认为是CRISPR 序列的启动子；重复序列包含5～7 bp 回文序列，转录出的发卡结构能够稳定RNA 的整体二级结构；间隔序列是被细菌俘获的外源DNA 序列。Cas 基因家族是可编码DNA 切割结构域的高度保守的与CRISPR 基座相关联的基因，其位于CRISPR 基座附近或分散于基因组其他地方。

1.2 CRISPR/Cas9 系统工作原理

根据Cas 蛋白组织不同，CRISPR/Cas 系统分为2 个类别，第1 类CRISPR/Cas 系统利用多蛋白效应复合物，而第2 类CRISPR/Cas 系统利用单蛋白效应物。其中，第2 类CRISPR/Cas 系统能产生用于加工crRNA、识别降解外源遗传物质的标志性蛋白Cas9。具体而言，这一过程是CRISPR 阵列经过转录、加工形成成熟的crRNA，并与核酸内切酶结合，完成与间隔序列互补的前间隔序列的识别和靶向切割，从而破坏外来遗传物质[5-6]。

2012 年，EMMANUELLE 和JENNIFER确认CRISPR/Cas9 基因编辑系统能在DNA 特定部位定点切开[2]。通过体外切割试验证明，Cas9 在基因工程中具有一定潜力[7]。CRISPR/Cas9 系统主要工作原理是通过tracrRNA 与crRNA 结合形成复合物，招募引导Cas9 蛋白定点切割DNA 序列。此外，研究人员进一步将tracrRNA 与crRNA 组成的复合RNA 进行融合改造，成为仅有一条RNA 链的引导RNA（single guide RNA，sgRNA）。在sgRNA 的引导下，Cas 蛋白扫描寻找靶标DNA 上的一段保守原间隔序列（Protospacer Adjacent Motif，PAM），当sgRNA与双链DNA 发生碱基互补配对时，Cas9 的2 个核酸酶催化中心对靶序列切割，产生DNA 双链断裂（Double Strand Breaks，DSBs），进而激发细胞内源的非同源末端连接（Non-homologous End-Joining，NHEJ）或同源重组（Homology-Directed Repair，HDR）修复机制，实现对靶标基因的定点编辑[8]。

2 基于CRISPR/Cas9 的基因组编辑策略

CRISPR/Cas9 系统设计非常简洁，其利用设计的特异性向导RNA 分子作为DNA 结合结构域从而替代了蛋白融合的过程。除此之外，相比以往2 种基因编辑技术，CRISPR/Cas9 系统的靶位点选择也极为灵活，由于该系统构建过程简便，编辑效率极高，致使其在短时间内飞速发展，逐步成为基因编辑领域的主流技术[9-10]。在CRISPR/Cas9 基因敲除技术的基础上，研究人员又相继开发出新型的单碱基编辑和引导编辑技术，进一步丰富了基因组编辑工具箱[11-12]。基于CRISPR/Cas9 系统的基因编辑技术主要通过以下策略对作物基因进行靶向修饰。

2.1 基于DNA 双链断裂的基因编辑

基因敲除是CRISPR/Cas9 系统中重要且广泛的应用之一。2013 年，张锋团队首次将CRISPR 技术应用到哺乳动物细胞内，并随后成功在小鼠和人细胞中实现了靶向诱导DSB[7]。自CRISPR/Cas 技术诞生以来，植物学家便立刻对其在植物中的适用性进行探索，期待开发出更高效的新型植物基因组编辑方式。SHAN 等[13]证明了定制的sgRNAs 可以指导Cas9 在2 种最广泛种植的粮食作物水稻（Oryza sativa）和普通小麦（Triticum aestivum）中诱导序列特异性的基因组修改。除了基因敲除以外，LI 等[14]借助NHEJ 途径产生基因替换和插入的内含子打靶方法，产生了抗草甘膦的水稻植株。通过设计1 对sgRNAs 靶向目标外显子两侧的内含子区域，以及一个包含相应核苷酸替换的供体质粒，产生2 个sgRNA 靶点之间的片段通过NHEJ 途径被目标核苷酸片段所取代的重组DNA 序列。这一方法成功实现了靶向基因插入，将5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）保守基序中2 个氨基酸成功替换从而赋予水稻草甘膦抗性[14]。

CRISPR/Cas 系统高效诱导水稻靶向突变的实践证实了该系统的通用性和高效性。但该方法产生和随机插入或缺失，在植物基因精确修改方面难以施展应用。植物细胞还可通过精准同源重组修复途径消除DSB，这一途径保真度高，被用来产生精确的基因修改。然而由于HDR 介导的靶向整合频率比NHEJ 低得多，并且需要外源修复模板的传递，故应用受到限制。其相关应用中一直存在效率低下的问题。对大豆的ALS1 基因进行HDR 介导的精准基因编辑，成功将178 位的脯氨酸突变为丝氨酸，但所有愈伤中只发生了一个这样的抗氯磺隆突变事件[15]。SAUER 等[16]使用单链寡核苷酸（single-stranded oligonucleotides，ssODNs）结合CRISPR/Cas9 组件对亚麻EPSPS 基因进行精确编辑，在3 个独立试验中，精确的EPSPS 编辑频率在0.09%～0.23%。单独或组合使用不同形式的外源DNA 模板，NHEJ 和HDR之间的相互竞争等因素均会影响基因敲入的效率。由于HDR 发生的频率很低，迫切需要一种简单、通用和有效的方法来实现DNA 片段的替换或敲入。

2.2 碱基编辑器

CRISPR/Cas9 介导的点突变都需要先在靶位点或其附近产生DSBs。尽管利用外源模板的情况下借助HDR 可以产生精确的突变，但由于细胞对断裂的响应会产生随机的插入或缺失，带来了不必要的副产物。碱基编辑无需DSBs、同源定向修复（HDR）过程或供体DNA 模板，即可在目标基因组位点将一个碱基对直接、不可逆地转换为另一个碱基对。dCas9 能够在靶位点结合但失去了切割的能力，当dCas9 与介导碱基转换的酶相结合时即有望直接在靶点进行点突变。2016 年，KOMOR 等[17]将胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1 与dCas9 连结形成一种新型胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine Base Editor，CBE），并通过不断优化和改造，得到了效率大幅度提高的BE3和BE4 版本，并在人和小鼠细胞中成功将胞嘧啶转变成胸腺嘧啶。其工作原理是：由于胞嘧啶和尿嘧啶的结构相似，利用胞嘧啶脱氨酶对C 脱氨可以形成U，在DNA 继续修复过程中，U 可被聚合酶识别为T，从而完成C 到T 的碱基编辑过程。BE 的产生受到了关注，并被用于不同物种进行尝试。2017 年，David Liu 实验室开发出腺嘌呤碱基编辑器（AdenineBaseEditor，ABE），该技术同样也是通过将dCas9蛋白和腺苷脱氨酶组成融合蛋白，以此来实现将碱基A 突变成G 的突变编辑[18]。这一过程是利用腺苷脱氨酶对A 脱氨可以形成I（次黄嘌呤），I 在DNA修复中被识别成G，从而实现A 到G 碱基编辑。CBE和ABE 是目前使用广泛的2 种单碱基编辑器，可以在不产生DSBs 的情况下，在目的基因的靶标位置高效地实现C 到T 或者A 到G 的碱基精准替换。目前植物中已建立了多版本高效CBE 和ABE编辑系统[19-21]，且被应用于作物农艺性状的改良。

ABE 和CBE 分别只能实现单一的A·T 到G·C和C·G 到T·A 转换，为了实现提高编辑灵活性，扩大靶向范围，LI 等[22]融合了胞苷脱氨酶和腺苷脱氨酶，从而得到兼具CBE 和ABE 功能的碱基编辑器即STEME，能够实现C 到T、A 到G 以及二者同时的转换。将nCas9 升级为nCas9-NG 得到的STEMENG，可靶向NG PAM。值得注意的是，STEME-NG 在植物细胞能产生种类丰富的突变，除了C 到T、A 到G，还有C 到G/A 和G 到C/T 及少量插入或缺失，适于定向进化。对OsACC 基因的定向进化发现了未经报道的抗ACC 抑制性除草剂的突变：P1927F和W2125C。该工具因为靶向范围广，能实现多种碱基转换，具备很强的通用性，能够在其他作物乃至动物细胞的蛋白进化中发挥更大的应用潜能[22]。

2.3 引导编辑器

CBE 与ABE 可以对C 到T 或者A 到G 碱基间进行转换，但无法实现对任意碱基转换。为解决这一问题，2019 年，David Liu 实验室开发了一种可在不产生DSB 且不引入供体DNA 的情况下实现基因精准编辑工具，称为引导编辑器（PE）[23]。引导编辑器在CRISPR/Cas9 的基础上进行改造，首先将nCas9（H840A）与逆转录酶（M-MLV）相融合形成新的融合蛋白，其次在sgRNA 3′末端增加一段包含引物结合位点（PBS）和逆转录模板（Reverse Transcriptase，RT）在内的RNA 序列，称作引导编辑器的向导RNA（Prime Editing Guide RNA，pegRNA）[24]，最后在pegRNA 的引导下，将nCas9（H840A）与逆转录酶M-MLV 复合物带至靶标位置，以pegRNA 上的反转录序列为模板，在逆转录酶作用下产生一段含有定点突变的单链DNA 序列，进而通过DNA 修复途径实现多种精准的基因突变。

引导编辑器无需DNA 模板和DSBs 便可实现所有碱基的自由转换（包括转换和颠换），具有很高的安全性和应用潜力。2020 年，高彩霞团队建立了适用于植物的引导编辑器（Plant Prime Editor，PPE），在水稻和小麦中利用PPE 可以产生各种类型的单碱基替换[25]。近乎同时期，先后还有其他5 篇文章报道了PE 系统在植物中的建立[26-30]。但是，起初发展的PPE 系统普遍效率低下，多个研究团队对其进行了进一步优化[31-33]。其中，2021 年，高彩霞团队通过设计双pegRNA 从而提高了水稻植株引导编辑效率[34]。随后，高彩霞团队在植物细胞及植物个体2 个水平上对引导编辑系统的脱靶效应进行深入评估。在对29 株引导编辑系统编辑的水稻植株进行了全基因组测序后，发现引导编辑未导致基因组出现单碱基突变和小片段插入或缺失等脱靶情况[35]。同年，David Liu 实验室对引导编辑器进行改良，开发了效率更高的引导编辑系统，称为PE4和PE5，并在哺乳动物细胞中得到验证[36]。引导编辑系统具有极高的编辑特异性，为人类疾病治疗和农作物育种等带来了无限可能。

3 利用CRISPR/Cas9 对作物性状改良

常规育种方式周期长，且受到各种因素限制，通过现代农业育种方式能够摆脱自然环境变化等一系列因素的干扰，从而缩短培育周期。如今CRISPR/Cas9 基因编辑及其相关衍生技术已被广泛应用于作物的遗传改良（表1），包括对作物与产量、质量、抗病、抗除草剂、抗非生物胁迫相关的基因定点编辑，能够高效且精确的改良现有作物的农业性状，在作物分子设计育种方面具有广阔前景。

表1 CRISPR/Cas9 在作物性状改良上的应用

3.1 提高产量

在作物育种中，最需要改进的性状之一就是产量。对于大多数作物来说，产量构成因素主要包括每穗粒数和大小、每株成穗分蘖数、粒质量及粒级[37，74]。2018 年MIAO 等[38]研究表明，与野生型水稻植株相比，CRISPR/Cas9 编辑创造的pyl1/4/6 三重敲除水稻变体产量高，穗粒长，主穗数更多，穗发芽更少。通过同时敲除水稻3 个与粒质量相关的基因（GW2、GW5 和TGW6），极大地增加了水稻粒质量[39]。通过敲除与营养分配有关的氨基酸渗透酶的编码基因OsAAP3，培育出了在保持水稻品质的同时分蘖数和籽粒产量提高的水稻品种[40]。还有研究表明，环型E3连接酶编码基因TaGW2 的敲除也被证实能增加小麦籽粒的粒长和粒宽，从而提高小麦产量[41-42]。在影响产量的因素中，调控细胞分裂素稳态是提高谷物产量一种切实可行的方式。敲除小麦中编码细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CKX）的基因TaCKX2-D1可有效增加其粒数，提高小麦产量[43]。利用CRISPR/Cas9 敲除突变细胞分裂素激活酶OsLOGL5基因CDS 区的3′末端，可增加穗粒数和粒质量，提高水稻产量[44]。

3.2 改良品质

随着人们生活水平的提高，对于作物品质的要求也随之增高。直链淀粉含量低的谷物具有更好的食用和烹饪价值，在纺织和黏合剂行业也得到广泛的应用。如今，通过CRISPR/Cas9 系统基因编辑技术，可以改善水稻直链淀粉含量、营养价值及香味。通过CRISPR/Cas9 系统对水稻Wx基因进行敲除，使得水稻直链淀粉含量降低[45，75]。与之类似，玉米Wx1基因也编码一种与籽粒组成有关的淀粉合成酶[46]，通过CRISPR/Cas9 系统敲除Wx1基因可以使玉米支链淀粉含量接近100%[47]，并且其他表型不发生变化。樊世婷[48]研究发现，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，对春大麦的Waxy基因编码区进行定点敲除，可以获得直链淀粉含量降低的编辑系，从而改良大麦种子的食用和加工品质。而水稻香味也是其中一种重要的品质，煮熟后带有香味的水稻品种更容易被人们购买选择，具有更高的商业价值。利用TALENs 和CRISPR/Cas9 系统将编码甜菜碱醛脱氢酶的基因OsBADH2敲除，可以增加水稻的香味[49，76]。敲除α-醇溶蛋白家族成员最保守的结构域，开发出的低筋、非转基因小麦品系，可降低遗传易感腹腔免疫反应[77]。CRISPR/Cas9 系统还被用于改良作物的营养成分，如提高番茄的番茄红素和γ-氨基丁酸含量，增加水稻的类胡萝卜素含量和产生高油酸大豆[50，78-81]。DAHAN 等[51]利用HDR 编辑番茄中的CRTISO基因，从而将受体材料中的胡萝卜素含量显著提高。等[82]利用双生病毒复制子，通过同源重组途径在番茄ANT1基因的启动子区域另外插入CaMV35S 启动子，实现ANT1基因的原位定点激活，并将番茄中花青素的含量提高数倍。此外，通过CRISPR/Cas9 技术还开发出更耐储藏的番茄[53]。综上可知，基于CRISPR/Cas9 系统基因编辑技术能够简便且有效的对作物进行一系列品质改良。

3.3 提高抗病性

CRISPR/Cas9 系统还用于作物抗病性的研究。白粉病是一种毁灭性的真菌病害。利用TALENs 和CRISPR/Cas9 技术，靶向突变六倍体小麦中3 个编码抗霉位点（MLO）蛋白的同源等位基因，可产生具有广谱抗白粉病的小麦品系[52]。通过突变小麦EDR1（编码MAPK 激酶的基因）的3 个同源基因，获得的Taedr1突变株对白粉病的抗性增强[54]。此外，CRISPR/Cas9 靶向编辑番茄的SlMlo1基因后，获得的敲除突变体也能对白粉病产生抗性[55]。水稻白叶枯病是由γ-变形菌属水稻黄单胞菌引起的一种毁灭性病害，严重威胁着水稻生产。在感染过程中，一组细菌因子可激活SWEET基因的转录，而SWEET基因的产物是缓解疾病易感性所必需的。通过使用CRISPR/Cas9 突变水稻SWEET11、SWEET13和SWEET14基因的启动子区域，可产生对细菌性水稻白叶枯病病菌具有广谱抗性的水稻品系[56-58]。另外，敲除乙烯反应因子转录基因OsERF922，可提高水稻对稻瘟菌的抗性[59]。赤霉病是一种严重影响小麦质量和产量的病害。TaNFXL1基因与禾谷镰刀菌致病性有关，TaNFXL1基因被定点敲除后，可以获得赤霉病抗性明显提高的小麦品种[60]。编码9-脂氧合酶的Lpx-1基因被定点突变后也可以提高小麦抗病性[83]。此外，利用CRISPR/Cas9 敲除手段，提高了植物对多种病毒的抗性，如水稻东格鲁病毒[84]、棉花曲叶病病毒[85]、花椰菜花叶病毒[86]、双生病毒[61]等。

3.4 提升非生物胁迫的抗性

干旱、盐分等非生物胁迫会对作物构成重大威胁，并造成巨大的经济损失。在非生物胁迫中，由于耕地污染，需要防止有毒重金属在作物中积累。通过剔除OsHAK1、OsARM1及OsNramp5基因，分别获得放射性铯、砷和镉含量降低的水稻[62-64]。ZmSRL5与玉米角质层蜡结构形成有关，突变ZmSRL5可以提高玉米的耐旱性[65]。对玉米乙烯反应的负调控因子ZmARGOS8基因的启动子区域进行基因编辑，也可以提高玉米的抗旱性[87]。周天顺等[88]选用超级稻恢复系“华占”为受体材料，利用CRISPR/Cas9 技术改良的突变体水稻对ABA 的敏感性降低、叶片水分散失速度减慢，提高了水稻耐旱、耐高温和耐渗透胁迫的能力。KUMAR 等[89]利用CRISPR/Cas9技术诱导籼稻抗旱基因发生突变，突变体在苗期表现出中等水平的耐渗透胁迫能力和高水平的耐盐能力，提高了籼稻品种的耐旱性和耐盐性。

3.5 增强除草剂抗性

杂草是限制作物产量的重要因素。商业化除草剂种类繁多，除草效果好，为粮食增产作出了巨大贡献，推动了农业现代化的进程。绝大多数除草剂以植物特定的代谢关键酶作为靶标，从而致死。开发抗除草剂的作物品种，能够扩展除草剂的应用范围，使除草剂应用更安全。自然界发现的除草剂抗性突变位点很多。将已发现的抗性突变引入作物就能获得抗特定除草剂的植株。以往通过传统育种方式已经开发出抗除草剂品种[90]，然而这样的育种毕竟耗时费力。CRISPR 技术缩短了这一过程，并且能同时获得多种除草剂抗性。

乙酰乳酸合成酶ALS是支链氨基酸生物合成的关键酶，所以开发出了许多以ALS 为靶标的除草剂，如磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂[66]。对ALS 基因自然发生的点突变研究表明，替换ALS 基因中的特定碱基可以赋予拟南芥除草剂抗性[91]。由于ALS基因的保守性，对不同植物的ALS抗性位点进行碱基替换都可以获得抗性突变株系。HDR 作为最初的碱基替换途径，需要使用和靶位点具有同源性的外源模板，RNA 作为修复模板成功在不同物种中修复DSB。sgRNA 作为修复模板更容易递送至靶标细胞当中，因此，BUTT 等[67]设计了嵌合sgRNA（chimeric sgRNA，cgRNA），有sgRNA 和修复模板双重功能。不同cgRNA 结构具有不同的编辑效率，用cgRNA/Cas9基因编辑平台对OsALS 进行定向基因编辑可快速高效地获得抗除草剂双草醚（Bispyribac Sodium，BS）的水稻。CBE 或ABE 靶向编辑水稻OsALS 基因，同样可以赋予水稻除草剂抗性[68-69]。利用CBE编辑小麦TaALS 基因，可产生具有抗除草剂性状的小麦突变株系[21]。另外，研究人员通过CBE 成功突变油菜乙酰乳酸合成酶基因BnALS，获得具有除草剂抗性的油菜[70]。TIAN 等[73]利用BE 改造西瓜的ALS，在T0的碱基编辑效率高达23%，获得了无转基因的抗除草剂西瓜。另外，还成功构建了抗除草剂大豆[15]。此外，利用CRISPR/Cas9 系统对玉米ZmALS2 基因进行精确替换，使编辑后的玉米材料具备氯磺隆抗性[92]。ZHANG 等[72]利用碱基编辑的手段进行抗除草剂小麦的开发，得到的无转基因小麦种质耐受磺酰脲类、咪唑啉酮类和芳氧基苯氧丙酸类除草剂。另外，烟嘧磺隆培养基可以直接作为筛选培养基进行初步筛选从而获得双重除草剂抗性的新品种，目前已利用这一方式获得了双突变体小麦，能对2 种除草剂产生抗性[72]。Target-AID 是将dCas9 和PmCDA1融合形成的合成复合物，可在酵母和哺乳动物细胞实现靶向核苷酸的C 到T 替换[69]。使用nCas9（D10A）的Target-AID 有着更高的效率，将Target-AID 经过密码子优化使其适于植物基因组编辑，并用于水稻ALS的精准编辑，能够赋予水稻除草剂抗性。ABE7.10可在实现精准的A·T 到G·C 转换，高彩霞团队利用这一工具对水稻OsACC 的2186 位进行Cys 到Arg的点突变，赋予了水稻除草剂抗性[71]。此外，通过精确编辑水稻OsTubA2 基因，成功获得具有三氟甲磺酸和二甲戊乐灵除草剂抗性的水稻种质[93]。

4 CRISPR/Cas9 局限性

虽然CRISPR/Cas9 及其相关的基因编辑技术发展迅速，目前已在作物基因功能解析和精准分子设计育种领域有着广泛的应用，但是其依旧存在着一些限制，其中主要包括编辑范围和植物遗传转化体系的限制。

4.1 编辑范围限制

CRISPR/Cas9 基因编辑技术加快了作物性状改良的步伐，然而CRISPR/Cas9 核酸酶的靶位点被相应PAM序列所限制，使其难以实现在任意位置上的编辑[94]。因此，如何对Cas9 蛋白进行相应地改造，拓展CRISPR 核酸酶对不同PAM 的兼容性，扩大CRISPR/Cas9 的可编辑范围，也决定了未来CRISPR系统在作物中能否广泛使用。2015 年，Keith 实验室研发出可识别NGA 的SpCas9-VRQR 突变体和识别NGCG 的SpCas9-VRER 突变体[95]，自此开始，不断出现能识别不同PAM 序列的各类变体，致使Cas9 的编辑范围大大增加。2018 年，David Liu 实验室所构建的xCas9 3.7 变体能有效识别NGG、GAA和GAT[96]，推动了CRISPR/Cas9 系统的进展。随之Nureki 实验室构建出可识别NG 的SpCas9-NG 变体，进一步扩展了可靶向范围[97]。之后，各实验室在现有基础上进一步拓展PAM识别位点。2020 年，David Liu 实验室构建出一系列SpCas9 突变体，致使可识别的PAM序列拓展至NRNH[98]。同年，Kleinstiver 实验室改造SpCas9 后得到突变体SpRY，可有效识别NRN 和NYN[99]。至此，SpCas9 及其突变体几乎摆脱了PAM的限制，极大地提升了作物基因编辑的范围，但编辑效率略有降低，未来依旧需要进一步优化，在实现对编辑范围扩展的前提下提升编辑效率。另有研究表明，编辑范围扩大会导致自我靶向，从而进一步降低编辑效率，影响编辑产物纯度，这也是Cas 变体应用受限的原因之一，这一问题的解决必将进一步扩大CRISPR 系统的应用范围。

4.2 转化系统限制

实现作物转基因高转化率离不开高效稳定的遗传转化系统。目前在利用基因编辑技术对作物进行遗传改良过程中，主要使用的转化系统是农杆菌介导法和基因枪轰击法。1983 年，研究人员利用农杆菌介导法成功转化烟草植株，随后，在作物遗传转化过程中，农杆菌介导植物遗传转化的方式不断改进，由于其转化效率最高，逐渐成为了目前最常用的植物遗传转化手段[100]。根癌农杆菌是一种来自土壤的革兰氏阴性菌，在自然环境下，农杆菌能感染双子叶植物伤口，并将T-DNA 通过宿主的DNA修复机制整合至宿主基因组中并表达[101]。农杆菌介导遗传转化就是利用这种DNA 转移机制从而将外源DNA 导入到植物基因组中。但由于农杆菌介导法对宿主范围有一定限制，并不能在所有作物植株和组织中适用。基因枪轰击法是利用高压气体加速将包被在金属微粒表面的外源基因导入受体细胞的一种DNA 直接转化方法。基因枪轰击法可以同时转化多个基因，还可以转入RNA 或蛋白，为植物基因组编辑提供了新的可能性。

在这些常规转化过程中，DNA 分子经常整合到基因组或目标DSB 位点，易于导致外源基因引入，存在基因安全风险[102]。RNA 引导的工程化核酸酶核糖核蛋白首先在哺乳动物细胞中应用。由于RNP容易降解，因而能够降低脱靶频率，并在人类细胞中实现了高频靶向突变[102]。DNA-free 利用CRISPR/Cas9 核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein complexes，RNPs）直接转入植物细胞中，无需转化手段即可完成对靶向基因的编辑。2015 年，WOO 等[103]利用预组装的CRISPR/Cas9 核糖核蛋白RNPs 将RNP 送至莴苣原生质体中。2016 年，SVITASHEV等[104]在玉米进行耐除草剂的基因编辑中，首次将预先组装的Cas9-gRNA 核糖核蛋白（RNP）导入玉米胚细胞，实现了对玉米ALS2的精确修饰。2017 年，LIANG 等[105]使用CRISPR/Cas9 核糖核蛋白复合物成功在小麦中完成DNA-free 编辑。2020 年，MA等[106]利用RNA 病毒载体向植物中递送CRISPR/Cas9 核酸内切酶，在烟草中成功完成DNA-free 编辑并能实现稳定遗传。虽然RNP 递送的方式脱靶率极低，但和DNA 载体传递方式相比，RNP 传递方式显示出显著降低的突变频率[104]。因而，在实际应用中要根据基因组编辑的需要和试验目标选择最优的方法。

5 基因编辑作物展望

2013 年，CRISPR/Cas9 系统首次对植物进行基因组编辑[13，107]。随后，CRISPR/Cas9 系统广泛运用在小麦[108]、水稻[109]、大豆[110]、玉米[89]等重要农作物中，逐渐形成了依赖于基因编辑技术的现代分子设计育种模式。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术编辑目标作物内源基因，利用后代杂交分离的方式剔除导入的外源基因，可获得不含外源基因基因编辑产物。相比于效率低下的传统育种方式，现代育种技术不仅效率高，同时也能克服传统育种方式育种过程缓慢复杂、不易结实等缺点，对于作物育种发展具有重要意义。随着测序技术不断发展，测序成本逐年降低，目前许多农作物的基因组测序工作已基本完成，为后续作物的遗传改良提供了极大的便利。尽管CRISPR/Cas9 基因编辑技术在作物育种应用中已取得了一些成果，目前该方法仍存在诸多问题。一方面，植物常用的转化方法主要是农杆菌介导法和基因枪轰击法，这2 种方法已十分成熟，但并不适用于所有的物种，寻找新的高效低成本的转化方式，有助于未来开拓出更多种类的基因编辑作物。另一方面，虽然单碱基编辑器能够定点编辑且不导致DNA 断裂，但其仍需要进一步优化，降低脱靶效率以保证编辑的精准。此外，由于基因编辑作物中携带外源基因，在大规模生产前需要将外源基因剔除，如何更高效精准地剔除外源基因，也是未来需要考虑的方向。尽管现代育种技术对于作物品质改良优势巨大，但由于市场的监管，绝大部分作物品种依旧只能在实验室中生产，暂时不能大规模批量培育，与普通非编辑作物一样进入市场中。但是相信日后对于基因编辑作物的管理方式也会逐渐缓和。综上，现代育种技术对于我国农业的发展意义重大，CRISPR/Cas9 技术的产生和发展极大地改变了作物育种方式，并有望在将来带来更多品种改良新种质，进一步推动科学研究和农业生产的发展。