“高粱不育系Tx623A×苏丹草Sa”RIL 群体农艺性状的QTL 定位

王丽华，陆叶飞，陆以静，刘言龙，李杰勤

（安徽科技学院农学院，安徽凤阳 233100）

高丹草作为高粱×苏丹草杂交种（Sorghum bicolor×Sorghum sudanense），是一种以收获茎秆、叶片为主的饲用作物[1]。我国高丹草遗传研究从20 世纪90 年代陈才夫等[2]开始苏丹草×拟高粱种间杂种的细胞学分析，到现在多个遗传连锁图谱的构建及性状定位等[3-5]，已取得了一些成就。

株高、穗长、分蘖、茎粗、单株鲜质量和单株干质量等性状是与产量紧密相关的重要农艺性状，这些性状的QTL（Quantitative Trait Locus）定位已在水稻[6]、玉米[7]、小麦[8]、大豆[9]、油菜[10]、高粱[11]、花生[12]等作物中有相关研究，但高丹草相关农艺性状QTL 定位研究较少，于肖夏等[13]以170 个F2单株为作图群体，利用50 对SSR 引物构建了高丹草分子遗传图谱，并对茎粗、叶宽等8 个性状进行QTL定位。石悦等[3-4]利用305 个F2分离单株和444 个AFLP 标记构建了高丹草分子遗传图谱，并对茎粗、叶片数、分蘖数等农艺性状进行了QTL 定位分析。房永雨等[5]利用高丹草F2分离群体构建了包含284 个AFLP 标记的分子遗传图谱，并对氢氰酸、单株干质量、株高等10 个性状进行QTL 定位分析。LU 等[14]利用248 株F2∶3单株构建了包含178 个标记（170 个AFLP，8 个RAPD）的高丹草分子遗传图谱，并对株高、茎粗、叶片数等10 个农艺性状进行QTL定位。

本研究利用在亲本间具有多态性的138 个SSR 标记对株高、茎粗、穗长、分蘖数、单株鲜质量、单株干质量6 个农艺性状进行QTL 定位，构建高丹草RIL 群体遗传图谱，对高丹草分子标记辅助选择育种具有指导意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以高粱不育系Tx623A 为母本、苏丹草恢复系Sa为父本[15]和杂交F9的126 个RIL 群体为试验材料。

1.2 试验方法

试验在安徽省凤阳县安徽科技学院进行。于2018 年5 月20 日种植，小区采用随机区组排列，种植密度为50 cm×25 cm，每行10 株，3 次重复，常规田间管理。

1.2.1 农艺性状测定 植株成熟后亲本和126 个RIL 群体株系分别随机选取5 株测定株高、茎粗、穗长、分蘖数、单株鲜质量和单株干质量[16]。

1.2.2 DNA 提取和SSR 标记分析 采用SDS（十二烷基硫酸钠）法[17]提取父母本（各2 株）和126 株RIL群体株系的植株叶片，通过实验室现有的1050 个SSR 标记对亲本进行多态性筛选。PCR 反应体系如表1 所示，PCR 程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸7 min 结束。利用浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR 产物。银染后读胶，母本带型记作“1”，父本带型记作“2”，杂合带型记作“3”，缺失记作“-”。

表1 PCR 扩增反应体系

1.3 数据分析

通过Joinmap 4.0 软件来构建遗传连锁图谱。第一步：建立数据文件，将Loc 文件转到Joinmap 状态下。第二步：利用LOD Groupings 命令分组，LOD 值默认为2～10。使用Greate Groups for mapping 命令作图，通过Kosambi 函数计算遗传图谱的距离[18]，使用QTL IciMapping 4.0 软件定位产量相关性状的QTL 位点。QTL 命名方法：q+性状英文首字母+所在染色体。

2 结果与分析

2.1 RIL 群体6 个农艺性状表型值分布特征

对亲本和RIL 群体的6 个农艺性状表型进行比较分析（表2），RIL 群体的平均株高为（133.92±48.05）cm，高于母本Tx623A 的株高，但低于父本株高和双亲平均株高；茎粗的平均值为（14.72±2.58）mm，远低于母本Tx623A，且低于双亲茎粗的平均值；单株鲜质量和单株干质量均低于双亲的单株鲜质量和单株干质量；穗长低于双亲穗长均值；分蘖数高于母本Tx623A，但远低于双亲分蘖数均值。株高、茎粗、穗长、分蘖数、单株鲜质量和单株干质量6 个农艺性状的偏度和峰度都不大，均呈连续性正态分布，适合进行QTL 定位分析。

表2 RIL 群体及亲本农艺性状的测定结果

2.2 RIL 群体农艺性状相关性分析

对6 个农艺性状进行相关性分析，结果表明（表3），除茎粗外，株高、穗长、分蘖数与其他4 个性状均呈极显著正相关。株高和单株鲜质量、单株干质量、穗长、分蘖数均呈极显著正相关，其中，株高与单株鲜质量的相关系数最大（r＝0.645）；单株鲜质量和单株干质量、穗长、分蘖数呈极显著正相关，其中，单株鲜质量与单株干质量相关系数最大（r＝0.571）；单株干质量和穗长、分蘖数呈极显著正相关。茎粗和株高、穗长、分蘖数呈负相关。

表3 RIL 群体6 个农艺性状的相关性分析

2.3 RIL 群体的分子遗传图谱构建

用1 050 个SSR 标记进行亲本间的多态性筛选。经鉴定共有192 对引物能扩增出清晰的条带且在2 个亲本间表现多态，多态性比例为18.29%。以筛选出的多态性引物对RIL 群体进行PCR 扩增和检测（图1），其中138 对引物成功用于构建连锁图谱。构建的遗传图谱总长度为1 606.7 cM，标记间平均距离为11.6 cM（图2）。1 号染色体上的标记最多，共有31 个；9 号染色体上的标记最少，仅有6 个。

2.4 重要农艺性状的QTL 分析

由表4 可知，本研究共检测到60 个QTL 位点，解释14.05%～68.58%的表型差异。其中，控制株高的QTL 位点有4 个，分别位于4、5、6 号染色体上，可以解释24.75%～33.59%表型变异，LOD 值为4.56～5.60；qPH-5 位于5 号染色体，定位于S59-GS321 之间，其加性效应为正值（5.47），表型贡献率为27.02%，其他位点加性效应均为负值。控制穗长的QTL 位点有27 个，单个QTL 解释14.05%～68.58%表型变异，LOD 值为4.57～31.73。qEL-1 位于1 号染色体，定位于GS53-GS93 之间，加性效应为正值，表型贡献率为68.58%；qEL-5 位于5 号染色体，定位于S15-S56 之间，加性效应为正值（11.88），表型贡献率为29.40%。控制分蘖数的QTL 位点有1 个，位于5 号染色体，定位于S15-S56 之间，该位点表现出负加性效应，表型贡献率为30.39%。控制单株鲜质量的QTL 位点有13 个，单个QTL 解释17.69%～36.40%表型变异，LOD 值为4.52～8.18。控制单株干质量的QTL 位点有15 个，单个QTL 解释20.32%～30.48%表型变异，LOD 值为5.15～9.77，单株鲜质量和单株干质量均表现负加性效应。未检测到控制茎粗的QTL 位点。

表4 RIL 群体的QTL 分析

续表4

更重要的是，8 个QTL 位点同时控制多个农艺性状。5 号染色体的S15-S56 区间控制穗长、分蘖数、单株干质量和单株鲜质量。3 号染色体的S248-S9 区间控制穗长、单株鲜质量和单株干质量。3 号染色体的S250-S11 区间、8 号染色体的TXP354-RAD8-4 区间、10 号染色体的S79-TXP129 区间，均控制穗长和单株干质量。1 号染色体的GS57-TXP204 区间控制单株鲜质量和单株干质量。5 号染色体的S56-GS325 区间控制株高和穗长。6 号染色体的S236-TXP104 区间控制株高和单株鲜质量。

3 结论与讨论

皖草3 号是由母本高粱不育系Tx623A 和父本恢复系苏丹草Sa 杂交而成，它既有高粱抗旱、耐涝、耐盐碱和产量高的特征，又有苏丹草适口性好、抗逆性强、分蘖能力强、营养价值高的特点[19]。皖草3 号根系发达，茎秆粗壮，穗形松散，草质柔软，氰化物含量低，单株长势强，适应范围广，是通过全国牧草品种审定委员会审定的品种[15]，在农区养殖业发展中具有很好的应用前景[20]。

SSR 标记因其数量丰富，提供信息量大等优点，广泛应用于遗传图谱构建与目标基因定位等研究中[18，21-23]。利用SSR 标记构建高粱遗传图谱及QTL定位已有成功应用，董维等[24]利用T70×P607 杂交F6的RIL 群体和81 对SSR 标记构建了遗传连锁图谱，并在第1、2、4、5、6 号染色体上检测到7 个与分蘖数相关的QTL。王成等[25]利用63 对SSR 标记和TAM428×Tx622B 的220 个F2单株构建了高粱抗蚜性状的遗传连锁图，并发现了1 个主效QTL。卢峰等[26]利用98 个SSR 标记和28 个INDEL 标记，定位了19 个与甜高粱茎汁混合锤度、茎秆质量和出汁率性状的相关QTL。但高丹草作为一种优质、高产、抗逆性强的牧草，利用SSR 标记进行高丹草遗传图谱构建和QTL 定位的相关研究很少，于肖夏等[13]利用50 对SSR 引物建立了包含10 个连锁群，总长度为803.13 cM的高丹草遗传连锁图；石悦等[27]利用10 对SSR 引物和11 对SRAP 引物构建了包括10 个连锁群，总长度为1 273.4 cM的遗传连锁图。本研究利用138 对SSR 引物对Tx623A、Sa杂交的F9126 个RIL 群体构建的高丹草遗传连锁图谱包含10 个连锁群，总长度为1 606.7 cM，标记间平均距离为11.6 cM的高丹草遗传图谱，共定位了60 个与株高、茎粗、穗长、分蘖数、单株鲜质量和单株干质量相关的QTL。

其中控制株高的QTL 主要分布于4、5、6 号染色体上，与于肖夏等[13]和LU 等[14]定位的株高QTL相比，本研究定位的5、6 号染色体上的3 个位点均为新位点，其表型贡献率均较高（分别为24.75%、27.02%和27.76%），可能为该性状的主效位点。本研究中控制分蘖数的QTL 位于5 号染色体上，与于肖夏等[13]研究结果一致。穗长QTL 在10 条染色体均有分布，其中1 号染色体位于GS53-GS93 区间的QTL 位点贡献率达68.58%，说明该位点为该性状的主效位点，可进一步进行验证和功能研究。单株鲜质量和干质量QTL 在除4 号染色体的9 条染色体上均有分布，而LU 等[14]只在1、3、6、7、9 号染色体上检测到相关QTL 12 个。茎粗性状可能由于标记数量较少或标记分布不够均匀，QTL 定位并没有关联到相关位点，在后续研究中将加大标记密度或根据参考基因组设计新的引物再次定位。本研究中5 号染色体的S15-S56 区间为多效性位点，同时控制株高、穗长、分蘖数、单株干质量和单株鲜质量5 个性状。在1、3、8、10 号染色体上也存在多效性位点，这可能是“一因多效”或多个基因间紧密连锁造成的[28]。本研究中60 个QTL 位点只有3 个是正向加性效应，说明RIL 群体的这6 个农艺性状的杂种优势主要来自于父本Sa。

本研究构建了“高粱×苏丹草”SSR 分子遗传图谱，总长度为1 606.7 cM，包含10 个连锁群，标记间平均距离为11.6 cM。对株高、茎粗、穗长、分蘖数、单株鲜质量和单株干质量性状进行QTL 定位分析；共定位了60 个QTL 位点，控制株高的4 个QTL，对表型的贡献率为24.75%～33.59%，控制穗长的27 个QTL 对表型的贡献率为14.05%～68.58%，控制分蘖数的1 个QTL 对表型的贡献率为30.39%，控制单株鲜重的13 个QTL 对表型的贡献率为17.69%～36.40%，控制单株干重的15 个QTL 对表型的贡献率为20.32%～30.48%，旨在为分子标记辅助高丹草高产育种奠定基础。