枸杞多糖通过Nrf2/HO-1信号对百草枯致肺损伤的保护作用

朱 宇，张志俊，刘科蓝

0 引 言

百草枯(paraquat, PQ)中毒是最常见的中毒类型之一。由于缺乏有效的特异性解毒药物，百草枯中毒患者的病死率极高，达到60%～80%[1]。由于肺部的主动摄取机制，百草枯常积聚于肺并引起肺损伤和肺纤维化。百草枯中毒引起肺组织病变的相关分子机制并不明确，主要涉及氧化-抗氧化失衡、脂质过氧化、炎症激活和细胞凋亡等病理生理过程[2]。近年来，中药以及中药相关活性成分对肺损伤的保护作用逐渐受到重视，如血必净[3]、牛蒡子苷元[4]等。其中枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, LBP)被认为具有抗氧自由基、抗肿瘤、免疫调节等作用，具备一定的转化应用价值[5]。本研究拟探究枸杞多糖对百草枯所致大鼠肺损伤的保护作用并初步探索潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂枸杞多糖(Solarbio, 纯度≥90%)，百草枯(Sigma公司)，羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量测定试剂盒(Solarbio)，髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)测定试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)活性测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，白细胞介素-1β(IL-1β)检测ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测ELISA试剂盒(上海碧云天公司)，蛋白质免疫印迹(Western blot)检测核转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、β-actin相关抗体(美国Abcam公司)。

1.2 动物实验分组及取材SPF级雄性SD大鼠24只(8～10周龄，体重200～220 g)由江苏省人民医院实验动物房提供，实验动物许可证号：SCXK(苏)2016-0002。饲养于相对湿度50%～60%、温度22～24 ℃的环境中，光照周期12 h，自由饮水和进食。采用随机数字表法分为3组：百草枯组(n=8)：腹腔注射百草枯(20 mg/kg)；PQ+LBP组(n=8)：腹腔注射百草枯(20 mg/kg)后灌胃给予枸杞多糖(400 mg/kg)；对照组(n=8)：腹腔注射等量等渗盐水。大鼠于实验后3 d麻醉处死并留取肺组织标本。

1.3 大鼠肺湿/干重比分析和羟脯氨酸含量检测测定大鼠肺湿/干重比检测时，取左肺擦干表面液体，称取其湿质量(W)，将其置于烘箱中晾干至恒重，称取干质量(D)，计算两者比值即为湿/干重比(W/D)。按照试剂盒标准流程检测检测肺组织羟脯氨酸含量。

1.4 MPO、MDA和SOD水平检测按照对应试剂盒说明书要求分别检测肺组织匀浆中MPO、MDA和 SOD的水平。

1.5 IL-1β、TNF-α表达水平检测采用ELISA试剂盒分别检测3组大鼠肺组织匀浆中炎症因子IL-1β和TNF-α的表达水平。

1.6 Western blot检测肺组织Nrf2和HO-1表达水平取大鼠肺组织按每100 毫克加1 mL组织裂解液，充分匀浆后收集上清并测定蛋白浓度。聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，湿转法转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，采用含有5%牛血清白蛋白(BSA)的封闭液封闭后，加入对应一抗，孵育后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，孵育后增强化学发光法(ECL)显色，条带灰度值采用Image J软件分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织学改变、湿/干重比和羟脯氨酸含量比较大鼠肺组织切片经HE染色后，在光镜下观察发现：百草枯组大鼠在腹腔注射百草枯 3 d后，肺部渗出明显增多，大量炎细胞浸润，肺泡塌陷，组织结构受损严重。与百草枯组比较，经枸杞多糖灌胃处理的PQ+LBP组大鼠肺部炎症渗出显著减少，炎细胞浸润得到一定的缓解，肺组织结构基本正常，见图1。与对照组大鼠比较，百草枯组大鼠肺组织的湿/干重比和羟脯氨酸含量显著增加(P<0.05)，而PQ+LBP组大鼠肺组织的湿/干重比和羟脯氨酸含量较百草枯组显著降低(P<0.05)，见图2。

图1 各组大鼠肺组织切片(HE染色 ×100)

2.2 各组大鼠肺组织MPO、MDA和SOD水平比较与对照组比较，百草枯组大鼠肺组织中MPO活性和MDA含量显著增加，而SOD活性降低(P<0.05)。与百草枯组比较，PQ+LBP组大鼠肺组织MPO活性和MDA含量下调(P<0.05)，而SOD水平显著增加(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肺组织MPO、MDA、SOD表达水平

2.3 各组大鼠肺组织IL-1β和TNF-α表达水平比较与对照组比较，百草枯组大鼠肺组织中IL-1β和TNF-α的表达水平显著增加(P<0.05)。与百草枯组比较，PQ+LBP组大鼠肺组织中IL-1β和TNF-α的表达水平下调(P<0.05),说明枸杞多糖能够降低大鼠肺组织中IL-1β和TNF-α的表达水平，见表2。

表2 各组大鼠肺组织IL-1β、TNF-α表达水平

2.4 各组大鼠肺组织Nrf2和HO-1蛋白表达水平比较与对照组比较，百草枯组大鼠肺组织Nrf2和HO-1的表达受到抑制(P<0.05)。PQ+LBP组大鼠肺组织Nrf2和HO-1蛋白表达水平较百草枯组显著上调(P<0.05)，见图3。

与对照组比较，*P<0.05；与百草枯组比较，#P<0.05图3 各组大鼠肺组织中Nrf2和HO-1分子蛋白表达水平

3 讨 论

百草枯导致的肺损伤和肺纤维化是中毒患者死亡的主要原因[6]，其发生发展的分子机制尚不明确，寻找有效的肺损伤和肺纤维化抑制剂对改善患者的预后具有重要意义[7]。近年来，多种中药活性成分在不同病因导致的肺损伤治疗方面的价值逐渐受到重视[8]。枸杞多糖作为枸杞的主要活性成分，主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、等多种水溶性复合多糖组成，具有重要的药理学活性，包括抗癌、抗氧化、抗衰老、免疫调节等作用[9-10]。

本研究通过构建大鼠动物模型发现，枸杞多糖能够减轻百草枯中毒导致的肺损伤、减少肺组织渗出、减少肺组织羟脯氨酸的沉积。通过对氧化应激相关分子MPO、MDA和SOD的检测和比较发现，枸杞多糖能够降低MPO活性和MDA水平，上调SOD活性，提示枸杞多糖有助于提升清除自由基的能力、抑制脂质过氧化反应、减少氧化应激造成的组织损伤。而PQ+LBP组大鼠肺组织中IL-1β和TNF-α的表达水平下调，表明枸杞多糖具有一定的抗炎作用。在相关分子机制研究方面，枸杞多糖处理后，大鼠肺组织Nrf2和HO-1蛋白水平上调，该通路参与多种组织器官的抗氧化应激反应，是机体重要的抗氧化损伤机制。此外，Nrf2/HO-1还具有调节免疫应激、抗炎、减少线粒体损伤和抗凋亡等作用[11-12]。

对于其他病因引起的肺部疾患，枸杞多糖也能发挥一定的治疗作用。Chen等[13]在小鼠和人肺微血管内皮细胞(HPMECs)两个水平研究枸杞多糖对脂多糖(LPS)诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的保护作用及分子机制，发现：枸杞多糖能够通过抑制NF-κB信号途径发挥抗凋亡和抗氧化作用，减少内皮细胞损伤，减轻肺部炎症和水肿。也有报道枸杞多糖通过Akt/eNOS 通路减轻LPS致ARDS小鼠肺损伤，发挥抗炎、抗氧化应激及抗凋亡作用[14]。对于病情稳定的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者中，枸杞多糖能够降低并稳定血清缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)浓度，抑制病情加重[15]。在肺纤维化研究方面，枸杞多糖能够抑制肺纤维化相关基因COL1A1和α-SMA的表达，减少肺组织羟脯氨酸的沉积，同时还能够抑制成纤维细胞过度增殖和转分化[16]。相关机制与百草枯中毒导致的肺纤维化发生发展关系密切，枸杞多糖是否能够抑制上述过程进而阻断百草枯所致的肺纤维化有待探讨。

综上所述，本研究中，枸杞多糖作为一种重要的植物活性成分对百草枯诱导的肺损伤具有较好的保护作用，同时能够发挥抗氧化应激和抗炎活性，Nrf2/HO-1信号途径可能参与这个过程。相关分子调控机制及转化应用前景还需进一步研究。