基于扫描电镜技术的甜玉米食味品质鉴评研究

黄文洁，陈中健，谭深源，肖仁仔，于永涛，刘建华，李文燕，晏石娟

（1.广东省农业科学院农业生物基因研究中心/广东省农作物种质资源保存和利用重点实验室，广东 广州 510640；2.广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】随着人们生活水平的提高及对高品质生活的追求，市场对优质甜玉米的需求日趋旺盛。食味品质是衡量甜玉米品质优劣的重要指标之一，果皮厚度和淀粉含量直接影响鲜食玉米的食用品质。探索建立一种简便、直观的从超微结构水平对甜玉米食味品质进行鉴定的方法，不仅有助于揭示不同类型甜玉米籽粒超微结构的差异及其与品质性状的相关性，而且有助于玉米籽粒果皮、淀粉粒等超微形态学研究，为优质甜玉米新品种培育和遗传改良提供数据支撑。【前人研究进展】玉米是我国第一大粮食作物，近年来年产量稳定在2 600 万 t 左右，占全国粮食产量的1/3 以上（2020 年国家统计局数据），2020年玉米播种面积达3 846.67 万hm2，居我国粮食作物播种面积首位［1-2］。甜玉米又称蔬菜玉米，作为新型果蔬、营养食品，因其优质、可口、风味独特、营养健康而深受广大消费者青睐［3-4］。相对于普通玉米，甜玉米中携带了1 个或多个可以显著提高籽粒含糖量的单一或双隐性突变基因（普甜玉米su1或su2、加强甜玉米su1和se、超甜玉米sh2或bt2）［5］，影响淀粉合成途径中部分还原性糖向淀粉转化，导致淀粉合成受阻，而蔗糖等糖类物质在胚乳中积累［6］。优质甜玉米具有果皮薄、柔嫩性好、淀粉含量低、可溶性糖含量高、口感好等特点［7］，这些特性属于作物品质性状范畴，受多基因的调控。基于基因组学［8］、转录组学［9］、代谢组学［10］及全基因组学关联分析［11］等多组学手段发掘鉴定玉米食味等品质性状相关的基因，促进了玉米品质形成及变化机制的研究。甜玉米果皮的柔韧性直接影响口感等食味品质，常用的鉴定方法主要有品尝法、测微尺法和硬度计法［12］，而胚乳的淀粉含量、淀粉粒大小与分布等超微结构与营养、食味等品质性状具有一定的相关性［13］，从超微结构水平进行品质鉴定将成为甜玉米食味品质鉴评的重要组成部分。

【本研究切入点】扫描电镜具有分辨率高、景深大和图像直观等优势，可清晰地观察样品外表面或截面的超微结构［14］，样品制备方法在很大程度上影响样品超微结构的成像质量。除了戊二醛固定法外，液氮断裂法［13］、低热烘干法［15］等样品制备方法已用于玉米淀粉粒超微结构的观察研究，但尚未见对这些方法进行比较研究的报道。上述方法均需进行前处理，实验过程复杂、周期长，而直接制样法则相对简便、亦尚未见相关报道。【拟解决的关键问题】本研究通过比较戊二醛固定法、低热烘干法和直接制样法等3 种不同样品制备方法在新鲜甜玉米籽粒超微结构成像质量上的优劣，优化并建立一种简便且能同时观察甜玉米果皮和胚乳超微结构的制样方法，并将其应用于不同类型甜玉米的食味品质鉴评。

1 材料与方法

1 试验材料

供试普通玉米B73、普通甜玉米C213、加强甜玉米C265、超甜玉米C103 和甜糯双隐玉米C221 等5 个品种均栽种在广东省农业科学院大丰实验基地，常规栽培，开花期人工授粉。于人工自交授粉后25 d，以新鲜饱满乳熟甜玉米籽粒为起始研究材料，后期采用取材位于果穗中部的新鲜甜玉米籽粒为试验材料。

试验仪器：二氧化碳临界点干燥仪（Samdri-PVT-3D，美国Tousimis 公司），离子溅射仪喷金（MSP-2S，美国IXRF systems 公司），扫描电子显微镜（Hitachi S-3400N，日本Hitachi 公司），全自动体视荧光及成像系统（Zeiss SteREO Lumar V12，德国Zeiss 公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 戊二醛固定制样法及扫描电镜观察 取新鲜甜玉米籽粒，用双面刀片小心快速在胚乳冠部横切，切成薄片，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定8 h；再用pH 7.4、0.1 mol/L 磷酸缓冲液常温漂洗3 次，每次15 min；分别用30%、50%、70%、80%、90%乙醇脱水15 min，然后用100%乙醇脱水3 次、每次15 min；用二氧化碳临界点干燥仪干燥后，用电镜导电胶粘台、离子溅射仪喷金，用扫描电子显微镜观察。

1.2.2 低热烘干制样法及扫描电镜观察 取新鲜甜玉米籽粒，35 ℃烘干72 h，用手轻轻横断掰开胚乳，尽量保持自然断开状态，断裂面朝上，用电镜导电胶粘台、离子溅射仪喷金，用扫描电子显微镜观察。

1.2.3 直接制样法及扫描电镜观察 取新鲜甜玉米籽粒，用双面刀片小心快速在胚乳中部横断切开，切成薄片，用电镜导电胶粘台、喷金，用扫描电子显微镜观察。

1.2.4 不同类型甜玉米籽粒外观形态观察成像取新鲜甜玉米籽粒，置于全自动体视荧光及成像系统下，调节合适光圈和倍数，应用Axio Vision Rel 4.8 软件拍照。

2 结果与分析

2.1 不同制样方法甜玉米果皮超微结构比较分析

果皮厚度是衡量鲜食玉米品质的重要指标，也是影响鲜食玉米食味品质的重要因素之一。本研究所用甜玉米籽粒粒型规则（图1A），采用戊二醛固定法、低热烘干法和直接制样法等3 种不同制样方法下所观察的果皮超微结构各有差异。由图1B 可知，戊二醛固定法甜玉米样品果皮完整细胞层，排列有序、层次错落有致，细胞层之间结构清晰可见，同时，还能辨别出糊粉层和淀粉胚乳层，淀粉胚乳细胞壁可见，腔室完整；由图1C 可知，低热烘干法甜玉米样品果皮细胞层相互黏连皱缩，分辨不出独立细胞层，糊粉层排列疏松不成形，淀粉胚乳层中看不到完整的胚乳细胞壁；由图1D 可知，直接制样法甜玉米样品果皮细胞层相互挤压，细胞腔室分辨不清，糊粉层排列有序，但是内容物不及戊二醛固定法清晰，淀粉胚乳细胞之间间隔可见，但细胞壁没有像戊二醛固定法样品那样裸露。

图1 不同制样方法下的甜玉米果皮超微结构形态比较Fig.1 SEM images of sweet corn pericarp under different sample treatments

2.2 不同制样方法甜玉米淀粉粒超微结构比较分析

甜玉米籽粒内淀粉粒的微观结构可以在一定程度上反映其营养物质组成，而营养品质是评价鲜食玉米的重要指标。与果皮结构类似，戊二醛固定法、低热烘干法和直接制样法等3 种不同制样方法下所观察到的淀粉粒结构也不尽相同（图2）。戊二醛固定法可以看到完整的胚乳细胞壁，饱满的近圆球状淀粉粒结构，淀粉粒呈聚集分布、排列紧密，外表比较光滑裸露，相互间分离比较好，淀粉粒间有粘连的基质蛋白（图2A、B）；低热烘干制样法辨别不出完整的胚乳细胞和单独内含淀粉粒形态，淀粉粒间有粘连不成形（图2C、D）；直接制样法能呈现出完整的胚乳的细胞，也能看到近圆球形的淀粉粒，但是与戊二醛固定法比较，淀粉粒的形态并不清晰（图2E、F）。

图2 不同制样方法下的甜玉米淀粉粒超微结构形态Fig.2 SEM images of starch endosperm of sweet corn under different sample treatments

2.3 戊二醛固定法应用于不同类型甜玉米果皮外观、细胞结构及显微形态等水平的品质鉴定

与其他方法相比，戊二醛固定法是获得甜玉米籽粒超微结构比较理想的方法。为了更好地验证该法能否清晰获得不同类型甜玉米籽粒超微结构特征，本研究以普通玉米B73 为对照，对不同类型的甜玉米果皮超微形态进行比较，结果显示：从籽粒外观上观察，不同类型的玉米籽粒外观大小差别不大，籽粒形状相似，但甜玉米比普通玉米B73 表面有一定的皱缩（图3 A、D、G、J、M），其中超甜玉米C103 和甜糯双隐玉米C221 外观有明显凹陷（图3J、M）。从籽粒结构来看，不同类型玉米结构层次有所不同，普通玉米B73 具有典型的果皮/种皮、外胚乳、糊粉层和淀粉胚乳4 层结构，果皮细胞间层次分明，排列整齐，腔室可见，外胚乳层细胞间排列致密度高，糊粉层细胞体积大，排列疏松，胚乳层细胞大而排列紧密，淀粉粒大而分散好（图3B、C）；普通甜玉米C213 果皮细胞整齐度参差不齐，外胚乳结构不明显，糊粉层细胞单层结构大，排列齐整，胚乳细胞层细胞结构不清晰（图3E、F）；加强甜玉米C265果皮层厚度增强，细胞层之间厚薄不一，单层糊粉层细胞变大，排列疏松，胚乳细胞层能看到凌乱的细胞壁结构（图3H、I）；超甜玉米C103 果皮层变薄，外胚乳和糊粉层结构均不明显，胚乳层细胞呈类蜂窝状，细胞腔室明显，细胞壁清晰（图3 K、L）；甜糯双隐玉米C221 果皮层细胞壁增厚，细胞排列齐整，糊粉层细胞大，胚乳层细胞不明显（图3 N、O）。

图3 不同类型甜玉米果皮外观和显微形态Fig.3 Appearance and microstructure of different types of sweet corn pericarp

2.4 戊二醛固定法应用于不同类型甜玉米淀粉粒形态、分布及超微结构等水平的品质鉴定

一般而言，普通玉米籽粒含淀粉73%、蛋白质9%、脂肪4%和诸如纤维的其他成分14%［16］，而甜玉米淀粉含量通常较普通玉米少，可溶性糖含量高。淀粉、蛋白质、脂肪和可溶性糖等物质对甜玉米食味品质起着决定性因素作用。其中淀粉在玉米胚乳中主要以淀粉粒形式存在，可以通过超微结构进行比较分析。从玉米籽粒淀粉分布来看，不同类型玉米籽粒中胚乳淀粉含量、分布、形态大小不同，普通玉米B73 淀粉粒呈现多边形或球形，淀粉含量高、分布均匀，淀粉颗粒大，淀粉体发育充实好，排列紧密（图4A、B）；普通甜玉米C213 淀粉粒较小，近圆球状，排列疏松，中间分布有基质蛋白（图4C、D）；加强甜玉米C265 淀粉粒大小不一，性状各异，有相互聚集也有独立存在，胚乳细胞内充满大量拉丝状基质蛋白（图4E、F）；超甜玉米C103 淀粉粒分布不均一、分布稀疏，淀粉颗粒也较小、更接近球形，表面更光滑，淀粉粒间隙大，淀粉粒外有少量絮状蛋白黏附（图4G、H）；甜糯双隐玉米C221 的淀粉粒大小不一，呈不规则的多面体状，分布不均一，淀粉粒间隙有粘连的基质蛋白（图4I、J）。与普通玉米B 73 相比，甜玉米的胚乳细胞结构疏松，淀粉粒个体较小，在测试样品中，淀粉粒大小以普通玉米B73 最大，其次是普通甜玉米C213 与甜糯双隐玉米C221 相似，然后是加强甜玉米C265，超甜玉米C103 最小。

图4 不同类型的甜玉米胚乳超微结构Fig.4 Endosperm ultrastructures of different types of sweet corn

3 讨论

扫描电镜具有制样简单、图像直观和分辨率高等诸多优点，但由于制样方法的不同往往会对生物样品造成损伤，导致在电镜下观察时常会失真或有假象。因此，扫描电镜样品制备方法对于获得高质量的超微结构图像至关重要。液氮制样法［13］是将甜玉米籽粒用戊二醛固定后再用液氮短暂冷冻后制样，该方法获得的超微结构图像质量与本研究的戊二醛固定法相似。本研究将新鲜玉米籽粒切薄片后再用戊二醛固定，不需要液氮，较简便，同时还降低了实验条件的要求。此外，本研究比较了戊二醛固定法、低热烘干法和直接制样法，发现戊二醛固定法能够较好地呈现出甜玉米果皮的结构层次、胚乳淀粉粒形态和表面结构；而低热烘干制样法和直接制样法虽然操作简单，但均没有获得满意的果皮和淀粉粒超微结构，提示戊二醛固定法制样可用于甜玉米果皮细胞层数、厚度，胚乳淀粉粒形态、分布及表面结构等超微水平的食味品质鉴评研究。

甜玉米籽粒的超微结构与品质性状之间存在相关性［17-19］，表现为不同类型甜玉米在果皮和淀粉粒等超微结构上存在明显差异。为了进一步验证基于扫描电镜技术的戊二醛固定制样法在甜玉米食味品质鉴评中的应用，我们比较分析不同类型的4 个代表性甜玉米品种籽粒果皮和胚乳淀粉的超微结构发现，与普通玉米相比，甜玉米的结构层次不清晰，尤其是超甜玉米外胚乳和糊粉层均不明显；超甜玉米的淀粉胚乳空隙大，淀粉粒小、分布稀落，提示这些特征与外观皱缩有一定的关联性。熊飞等［20］比较了甜玉米、普通玉米和糯玉米3 种不同类型的成熟干籽粒超微结构，结果显示甜玉米籽粒超微结构与本研究的新鲜超甜玉米类似，均为胚乳细胞大、排列疏松，淀粉粒大多呈圆球状、排列松散，淀粉粒与胚乳细胞间隙大；但不同类型甜玉米在超微结构上存在一些不同，本研究中超甜玉米的淀粉粒大小差异不大，而加强甜玉米的淀粉粒大小差异大，普通甜玉米的淀粉粒大、形状不均一，表明甜玉米胚乳淀粉粒的大小与品种相关。

4 结论

本研究以新鲜甜玉米籽粒为研究对象，通过比较戊二醛固定法、低热烘干法和直接制样法等3 种扫描电镜制样方法，发现戊二醛固定法是一种理想的获得甜玉米籽粒果皮细胞结构层数、厚度及淀粉粒形态与分布等超微结构的方法。从超微结构水平，应用戊二醛固定制样法对不同类型的甜玉米果皮和淀粉粒等两个与食味品质密切相关的指标进行比较分析表明，普通玉米、普通甜玉米、加强甜玉米、超甜玉米和甜糯双隐玉米的籽粒外形、籽粒结构、果皮结构，淀粉粒外形、密度、大小，以及基质蛋白等均存在差异，与传统品尝法鉴定结果基本相一致。综上，本研究结果表明，戊二醛固定法能够可以获得清晰地甜玉米籽粒果皮和淀粉粒等超微结构图像，其超微结构的差异可以间接反映甜玉米品质的优劣，该方法可应用于甜玉米的品质鉴评及遗传改良研究。