气相色谱法测定酒类中乙醇含量方法优化

◎ 冯雪红，蔡伟源，罗培余，邹清辉，周建平

（1.天地壹号饮料股份有限公司，广东 江门 529000；2.广东天地壹号食品研究院有限公司，广东 江门 529000；3.广东省壹柑园食品有限公司，广东 江门 529000）

检测乙醇含量有多种方法，其中气相色谱法又分为外标法和内标法[1-3]，内标法较外标法更为精准。由于《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》（GB 5009.225—2016）[4]方法中，其主要使用玻璃填充柱，存在色谱理论塔板数较低、分离度差、易干扰等缺点，且内标法中使用的正丁醇或4-甲基-2-戊醇在水中的溶解度均不高，在实际操作过程所需较长时间才能完全溶解，效率较低，易造成内标峰面积差异大，影响测定结果。

为克服《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》（GB 5009.225—2016）方法中存在的不足，本文在现有标准的测定方法的基础上，参考《食品安全国家标准 食品中甲醇的测定》（GB 5009.266—2016）[5]，通过优化色谱条件和内标物选择，以提高检测回收率和检测效率。本方法可对果酒、葡萄酒和酒进行乙醇含量的测定，并以苹果酒为例对优化后的方法进行讨论。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

苹果酒，天地壹号饮料股份有限公司发酵车间生产；葡萄酒，长城干红，中国长城葡萄酒有限公司；啤酒，雪花纯生，华润雪花啤酒（中国）有限公司。

1.1.2 试剂

无水乙醇：色谱纯，CNW Technologies GmbH；叔戊醇：色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司；4-甲基-2-戊醇，分析纯，纯度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 仪器

GC-2014C气相色谱仪（岛津公司）；全玻璃蒸馏装置（北京玻璃集团泰州博美玻璃仪器厂）；HQ-60-IV涡旋振荡器（北京北方同正生物技术发展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 乙醇标准系列工作液的配制

配制乙醇标准系列工作液：取5个100 mL容量瓶，分别吸入2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL和7.00 mL乙醇，用水定容至刻度，混匀。分别将不同浓度的乙醇标准系列工作液10 mL置于25 mL容量瓶中，分别加入0.2 mL叔戊醇，涡旋振荡1 min，得到乙醇标准系列工作液。

1.2.2 样品前处理

吸取苹果酒100 mL试样于500 mL蒸馏瓶中，加入100 mL水和几颗沸石，连接冷凝管，用100 mL容量瓶作为接收器，外加冰浴，并开启冷却水，缓慢加热蒸馏，收集馏出液；当接近刻度时，取下容量瓶，待溶液冷却至室温后，用水定容至刻度，混匀。吸取10.0 mL蒸馏后的溶液于试管中，加入0.10 mL内标物叔戊醇标准溶液，混匀，备用。

1.2.3 色谱条件

色谱柱选用聚乙二醇-20M为固定相的石英毛细柱。柱长30 m×孔径0.25 mm×膜厚度0.25 μm。柱温及升温程序具体为：50 ℃，保持2 min；5℃·min-1升温至 90 ℃；25 ℃·min-1升温至190 ℃，保持3 min。进样口和检测器温度：250 ℃；载气（高纯氮）流量：1.0 mL·min-1；控制方式：线速度；吹扫流量：3.0 mL·min-1；进样量：1.0 μL；分流比：1 ∶ 99；尾吹流量：30 mL·min-1；氢气流量：40 mL·min-1；空气流量：400 mL·min-1。

1.2.4 样品测定

分别吸取不同浓度的乙醇标准系列工作液和处理后的试样溶液，按1.2.3的色谱条件进样测定，以乙醇浓度为横坐标，以乙醇和内标峰面积的比值为纵坐标，绘制工作曲线。

2 结果与分析

2.1 溶解时间、保留时间

GB 5009.225—2016方法与优化后的方法内标物的溶解时间、保留时间以及乙醇色谱峰保留时间见表1、图 1、图 2。

从表1中可以看出，使用GB 5009.225—2016方法，试样与内标物溶液混合时，溶解时间为6 min，这是由于内标选择上的乙醇标准使用溶液浓度为2%vol～10%vol，为高水相溶液，选择4-甲基-2-戊醇作为内标液，混合振摇后易形成油滴状悬浮液分散在溶液和黏附容器壁上，导致溶解不完全，均匀性不佳。而使用优化后方法，试样与内标物溶液混合时间为2 min，这是因为使用选择叔戊醇作为内标物，能缩短溶解时间并提高溶解度，从而提高测量的准确度。

表1 溶解时间、保留时间对比表

从图1、图2中可知，乙醇保留时间约为4.2 min，优化后方法（使用叔戊醇作为内标物）内标物的保留 时 间 约 为 5.2 min。GB 5009.225—2016方 法（ 使用4-甲基-2-戊醇作为内标物）内标物的保留时间约为8.6 min。在保证分离度到达要求的前提下，优化后方法能够减少内标物的保留时间，可有效提高检测效率。

图1 GB 5009.225—2016方法苹果酒样品色谱图

图2 优化后方法苹果酒样品色谱图

2.2 色谱峰分离效果与精度

GB 5009.225—2016方法与优化后方法的色谱峰分离效果、线性和精度对比结果见表2、表3。从表2和表3数据可以看出，①色谱峰分离度：优化后方法的内标物更接近乙醇出峰。叔戊醇与相邻峰分离度（分辨率）约为13.9；4-甲基-2-戊醇与相邻峰分离度（分辨率）约为20.3，均满足分离度≥1.5的要求。②线性相关系数：线性相关系数R越接近1.0，线性越好，测量结果越准确。GB 5009.225—2016方法的线性相关系数R为0.941 8，而优化后方法的线性相关系数R为0.998 8，说明优化后方法线性更好。③精密度对比：GB 5009.225—2016方法由于使用4-甲基-2-戊醇作为内标，存在溶解度问题，导致精密度较差，相对标准偏差为3.0%，而优化后方法使用叔戊醇作为内标，能够避免出现GB 5009.225—2016方法存在的问题，使相对标准偏差降低到1.3%。

表2 色谱峰分离效果和线性表

表3 相对标准偏差表（n=6）

2.3 加标回收率

按1.2.2中进行前处理，当蒸馏液接近刻度时，取下容量瓶，待溶液冷却到室温后，添加相应体积的乙醇到容量瓶，用水定容至刻度得到3个不同水平的加标样。对苹果酒进行乙醇加标回收率的试验，分别向试样溶液添加0.5%vol～2.0%vol的乙醇，使用优化后方法的回收率为99.0%～102.0%，而使用国标方法的回收率为93.0%～108.0%，说明使用优化后方法加标回收率更理想。3个水平加标回收率见表4。

表4 3个水平加标回收率表

优化后方法除了适用于测定果酒中的乙醇含量外，还适用于葡萄酒和啤酒中乙醇含量的测定。参照上述优化后的方法对葡萄酒或啤酒进行乙醇含量的测定，结果表明，在线性、分离度、精密度和加标回收率等指标优于GB 5009.225—2016的方法。

3 结论

《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》（GB 5009.225—2016）中，由于内标物在水中的溶解度较低导致标准曲线的线性、精密度和回收率等各方面均较差，且选用的内标物本身保留时间较长不利于提高检测效率。研究通过优化色谱条件以及选择叔戊醇作为内标物，能够加快标准溶液和样品处理过程，使标准溶液和样品溶液更加均匀，缩短了样品处理时间，提高了测量的准确度，为酒类中乙醇含量的测定提供了一种有效途径。