响应面法优化苹果酒澄清工艺研究

李涛，冯翰杰，杨梅，张军

（天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300392）

苹果营养丰富，富含矿物质和维生素，是一种低热量水果，每100克苹果只产生251.15 kJ热量，对美容和减肥具有一定的功效[1-3]。苹果酒以苹果为主要原料，经破碎、软压取汁、控温发酵、陈酿等工艺酿制而成[4]。苹果酒营养丰富，除了含有苹果中的营养物质外，还具有低温发酵生成的酸类、酯类以及蛋白质类等有机营养物质。研究表明，经常饮用果酒能软化血管、降低血脂、促进人体新陈代谢和美容等功效[5]。

随着人们生活水平的提高，对酒类的消费需求越来越趋向理性化、个性化、多样化，包括苹果酒在内的有特色、营养健康的果酒越来越受到消费者的青睐[6]。但由于苹果酒中含有较多的酚类、蛋白质、果胶等物质，在运输、加工和贮存过程中容易产生沉淀，酒体浑浊，造成酒品质下降[7-8]。为提高苹果酒的品质，使苹果酒获得良好风味的同时，能够保持较长时间的稳定，本试验采用单因素及响应面法对苹果酒的澄清工艺进行研究，测定苹果酒澄清处理前后的酒精度、总酸、总糖、透光率及感官评分，以探讨适合苹果酒澄清的最佳条件[9-10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果，山西红富士；F15酵母、皂土，法国Laffort公司；果胶酶，河南万邦实业有限公司；亚硫酸，天津科茂化工试剂有限公司；白砂糖，北京糖业烟酒集团有限公司；交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、明胶，实验室提供；蛋清粉，安徽省亳州市众意蛋业有限责任公司。以上试剂均为食品级。

1.2 仪器与设备

L系列紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；TD5002A电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；TGL-16C高速离心机，上海安亭科学仪器厂；生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 澄清剂的配制

皂土溶液：称取0.5 g皂土，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，浸泡12～24 h，使皂土完全膨化，配制成1%的皂土溶液，备用。

PVPP溶液：称取0.5 g PVPP，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，配制成1%的PVPP溶液，备用。

蛋清粉溶液：称取0.5 g蛋清粉，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，配制成1%的蛋清粉溶液，备用。

明胶溶液：称取1 g明胶，加入100 mL蒸馏水，浸泡24 h后去掉杂质，加热煮沸至明胶全部溶解，配成1%的明胶溶液，降至室温，备用。

1.4 试验方法

1.4.1 苹果酒的酿造

精选原料：挑选无污染、无破损、成熟度好的大果。

破碎取汁：将挑选好的苹果用清水洗去表面的杂质及泥土，控干水分，用榨汁机进行破碎，将自流汁收集并及时加二氧化硫（40 mg/L），密封处理，防止苹果汁褐变氧化。

酶解澄清：将收集好的苹果汁添加 0.02 g/L果胶酶，低温酶解12～15 h，酶解后分离上清液，用白砂糖调整糖度为220 g/L。

接种酵母：酵母添加量为0.2 g/L，将称量好的活性干酵母于37 ℃水浴锅中活化25 min，加至苹果汁中并搅拌。

控温发酵：将接种酵母的苹果汁置于20 ℃恒温培养箱中培养，当还原糖含量低于4 g/L时，终止发酵。

自然澄清：将发酵结束的苹果酒沉淀分离，倒入新罐中满罐陈酿，进行澄清。

1.4.2 苹果酒最佳澄清波长的确定

取陈酿好的苹果酒10 mL于离心管中，5 000 r/min离心5 min，以蒸馏水为空白对照，测定300～800 nm波长下苹果酒的透光率，绘制曲线，确定苹果酒最佳澄清波长。

1.4.3 不同澄清剂对苹果酒澄清效果的影响

取25 mL比色管24支，每支加入20 mL苹果酒，分成4组，每组分别加入不同质量浓度的皂土、PVPP、明胶和蛋清粉溶液，放入 15 ℃恒温箱中澄清3 d，取上清液测其透光率，研究不同澄清剂对苹果酒澄清效果的影响。

1.4.4 温度对苹果酒澄清效果的影响

取25 mL比色管6支，每支加入20 mL苹果酒和1 g/L皂土溶液，放至温度为5、10、15、20、25、30 ℃的环境中澄清，3 d后取上清液测其透光率，研究温度对苹果酒澄清效果的影响。

1.4.5 澄清时间对苹果酒澄清效果的影响

取25 mL比色管6支，每支加入20 mL苹果酒和1 g/L皂土溶液，在10 ℃条件下，分别静置12、24、36、48、60、72 h后取上清液测其透光率，研究澄清时间对苹果酒澄清效果的影响。

1.4.6 响应面试验设计

通过单因素试验，选择皂土为最佳澄清剂进行响应面试验，以皂土添加量（A）、澄清温度（B）、澄清时间（C）3个因素为自变量，透光率为响应值，应用Box-Behnken中心组合的方法进行试验设计，构建二次回归方程数学模型，对苹果酒澄清工艺进行优化。响应面试验因素水平表见表1。

表1 Box-Behnken设计响应面试验因素水平表

1.5 数据处理

采用 Design-Expert 8.0.6进行响应面设计与分析，使用Excel 2016对数据进行统计分析。

1.6 理化指标检测

苹果酒中糖度、酸度、酒精度的测定和感官评价方法参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

2 结果与分析

2.1 苹果酒透光率最佳检测波长的确定

由图1可知，随着检测波长的不断增加，苹果酒的透光率也随之增加，当波长为640 nm时，透光率达到最大值，为 99.9%，之后随波长的不断增加，透光率基本保持不变。因此，确定检测苹果酒透光率的最佳波长为640 nm。

图1 苹果酒透光率曲线

2.2 澄清剂对苹果酒澄清效果的影响

由图2可知，4种澄清剂对苹果酒均有澄清效果，其透光率值均大于未经澄清处理的苹果酒原酒（T＝79.8%）。在相同试验条件下，皂土澄清效果优于其他3种澄清剂。从图2 a可以看出，随着皂土添加量的增加，苹果酒透光率呈先增大后减小的趋势，当皂土添加量为1.0 g/L时，透光率达到最大值，为99.7%，当用量超过1.0 g/L时，透光率反而有所下降。这时酒体中产生了白色絮状物，这是由于皂土吸水膨胀后形成的胶体悬浮液带负电，与酒体中带正电的蛋白质、单宁和金属离子等物质相互吸引，产生絮状沉淀，使酒体得以澄清，当皂土添加量大于1.0 g/L时，苹果酒中带正电的物质被全部吸附，过量的皂士又会形成新的絮状物，使苹果酒的透光率逐渐降低[11]。从图2 b、2 c、2 d可以看出，PVPP、明胶、蛋清粉3种澄清剂对苹果酒均有一定的澄清作用，随着澄清剂用量的增加。其透光率值也随之增加，但透光率均小于皂土澄清的苹果酒透光率，当透光率达到最大值之后，随着澄清剂添加量的增加，透光率值逐渐降低，这主要是由于不同澄清剂的作用机理不同而导致[12-13]。因此，在本试验条件下，苹果酒的最佳澄清剂为皂土，其最适添加量为1.0 g/L，后续选择0.9、1.0、1.1 g/L三个水平做响应面试验进行优化。

图2 澄清剂对苹果酒透光率的影响

2.3 温度对苹果酒澄清效果的影响

由图3可知，当温度在5～10 ℃时，随着温度的升高苹果酒透光率也逐渐增加，当温度达到10 ℃时，透光率达到最大值，为99.9%。之后，随着温度的升高，透光率逐渐降低，说明高温不利于皂土的澄清。因此，选择5、10、15 ℃三个温度水平做响应面试验进行优化。

图3 温度对苹果酒澄清效果的影响

2.4 澄清时间对苹果酒澄清效果的影响

由图4可知，随着澄清时间的增加，苹果酒透光率也随之增大，当澄清时间为36 h时，透光率达到最大值，为 99.8%。之后，随着澄清时间的增加，透光率值基本保持不变。因此，苹果酒最佳澄清时间为36 h，选择36、42、48 h三个水平做响应面试验进行优化。

图4 澄清时间对苹果酒澄清效果的影响

2.5 响应面试验结果及分析

2.5.1 响应面试验设计及结果[14]

在单因素试验基础上，以皂土添加量（A）、澄清温度（B）、澄清时间（C）为自变量，透光率（Y）为响应值进行三因素三水平响应面试验，对苹果酒澄清工艺进行优化，确定苹果酒澄清工艺的最佳条件。试验设计及结果见表2所示，方差分析及相关系数见表3、表4。

采用Design-Expert 8.0.6软件对表2试验结果及分析进行多元回归分析，得到二次多项模型回归方程：

表2 Box-Behnken试验设计及结果

由表3可知，该模型P＜0.000 1＜0.01极显著，失拟项P＝0.731 8＞0.05不显著，说明该模型拟合度较好，模型回归方程能很好地预测试验结果[15]。一次项A、B的P值分别为0.000 2、0.000 5，均小于0.01，说明因素A、B对苹果酒透光率的影响极显著；交互项AB的P值为0.002 7＜0.01，说明因素AB对苹果酒透光率的影响极显著；二次项A2、B2、C2的P值均小于 0.000 1＜0.01，说明因素A2、B2、C2对苹果酒透光率的影响极显著；一次项C和交互项AC、BC的P值均大于0.05，说明因素C、AC、BC对苹果酒透光率的影响不显著。因此，对苹果酒透光率的影响因素由高到低依次为：皂土添加量＞澄清温度＞澄清时间。

表3 回归模型的方差分析

由表4可知，R2＝0.992 2，R2adj＝0.982 1，说明该模型的拟合度较好，自变量与响应值之间线性关系显著，能解释98.21%的变化；R2pred＝0.959 2，说明该模型预测性较好。变异系数CV为0.10%，小于5%，表明方程有良好的重现性。信噪比为30.390，远远大于 4，说明模型可信度非常高。因此，可利用此模型对苹果酒澄清工艺进行预测和分析。

表4 方差相关系数

2.5.2 响应面分析

响应面自变量的响应值及自变量之间的关系能够通过三维图和等高线进行预测和检验[16]。如图5 a所示，AB的等高线呈椭圆形，交互作用极显著，说明皂土添加量与澄清温度对苹果酒的透光率影响很大，随着皂土添加量与澄清温度的增加，苹果酒的透光率也逐渐增大，当增大到一定程度后，透光率又开始减小，说明过高或过低的温度或皂土添加量对苹果酒的透光率都有影响。如图5 b、5 c所示，BC、AC的等高线呈近似椭圆形和圆形，说明澄清温度与澄清时间、皂土添加量与澄清时间之间有交互作用，但是交互作用不显著。

图5 各因素交互作用对苹果酒澄清效果的影响

2.5.3 验证试验

经回归模型预测分析得到苹果酒澄清工艺最佳条件为：皂土添加量1.02 g/L、澄清温度9.58 ℃、澄清时间 42.18 h，苹果酒透光率预测值为99.693%。为方便操作，将最佳澄清工艺条件调整为：皂土添加量1.02 g/L、澄清温度9.6 ℃、澄清时间42.2 h。在此工艺条件下进行3次平行验证试验，得到苹果酒透光率实际值为（99.7±0.1）%，实际值与预测值相差不大，说明该工艺可行。

2.6 苹果酒澄清处理前后各理化指标及感官评价

2.6.1 澄清处理前后苹果酒各理化指标变化

由表5可知，经澄清处理的苹果酒各理化指标跟原酒相比，差异不显著，但透光率跟感官评分明显高于原酒，差异极显著。澄清处理后的苹果酒感官评分及透光率较高，主要是由于皂土吸附了酒体中带正电的蛋白质、单宁和金属离子等物质，产生了絮状沉淀，透光率大大提高，使酒体得以澄清，从而提高了感官评分[11]。

表5 苹果酒澄清处理前后各理化指标的变化

2.6.2 澄清处理前后苹果酒感官评分雷达图

由图6可知，经澄清处理的苹果酒各项感官评分均高于原酒，酒体跟原料特性（果香）得分相差最高。经皂土澄清处理的苹果酒酒体澄清透明，果香浓郁，呈秸秆黄色，口感圆润复杂，酸甜平衡，典型性强；未经澄清处理的苹果酒酒体浑浊，香气较淡，口感略粗糙。

图6 苹果酒原酒及最佳澄清工艺处理后的苹果酒感官评分雷达图

3 结论

通过单因素及响应面试验对苹果酒澄清工艺进行优化，采用Box-Behnken 设计方法构建二次回归方程数学模型进行响应面分析，确定苹果酒最佳澄清剂为皂土，最佳澄清条件为：皂土添加量1.02 g/L、澄清温度9.6 ℃、澄清时间42.2 h。在此条件下，苹果酒透光率为 99.7%，跟未澄清处理的原酒相比，透光率提高了 24.9%，感官评分较高，为90分，且澄清处理后的苹果酒跟原酒相比，总糖、总酸及酒精度基本不变。