LncRNA XIST对顺铂诱导的肝癌细胞活力和凋亡的影响

吴 伟，杨耀辉，王亚奇，王艳瑛，唐 强

1)驻马店市中心医院肝胆胰脾外科 河南驻马店 463000 2)河南省人民医院肝胆胰腺外科 郑州 450003

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma ，HCC)是世界上最常见的实体肿瘤之一，是世界第三大癌症死亡原因，其发病率呈上升趋势[1]。由于肿瘤转移和对常规化疗药物耐药，HCC易复发。深入了解化疗耐药的分子机制对于改善HCC预后至关重要。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的RNA，是一种潜在的生物调控因子，在基因翻译、基因转录、表观遗传调控和RNA转换等诸多领域受到人们的关注[2]。LncRNA通过miRNA参与癌细胞化疗耐药的调控，如LncRNA MALAT1作为miR-200a海绵，可促进肺癌细胞的增殖和吉非替尼耐药[3]。LncRNA SDHAP1通过miR-4465上调EIF4G2表达，调控卵巢癌细胞的紫杉醇耐药[4]。近年来，LncRNA XIST被报道在多种组织中发挥普遍的致癌作用[5-7]。XIST与miR-124相互作用，通过靶向雄激素受体调节膀胱癌细胞的生长、侵袭和迁移[8]。XIST通过let-7i/bag1轴促进人肺腺癌细胞对顺铂(CDDP)耐药[9]。本研究中，我们拟探讨XIST对CDDP诱导的肝癌HepG2细胞活力和凋亡能力的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及仪器HepG2细胞购自上海弘顺生物科技有限公司。DMEM培养基和胎牛血清购自中国赛默飞世尔科技公司。点突变试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。CDDP购自美国Selleck公司。XIST-siRNA及其对照(siRNA-NC)、XIST-pcDNA及其对照pcDNA-3.1(+)、miR-133a mimic及其对照(mimic-NC)、miR-133a抑制剂及其对照(抑制剂NC)质粒均由GenePharma公司合成；Turbofect试剂来自美国Invitrogen公司。Bax、Bcl-2、Wnt、β-catenin、Caspase-3、Caspase-9抗体和GAPDH多克隆抗体购自上海圣克鲁斯生物公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物有限公司。CCK-8试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司。实时荧光定量RCR试剂盒为日本TaKaRa公司产品。实验所用引物序列见表1，由北京擎科生物科技有限公司设计并合成。

表1 引物序列

1.2 XIST与miR-133a靶向关系的验证采用miRanda预测XIST潜在的靶基因。通过分子克隆方法构建野生型(wt)XIST载体，再通过点突变试剂盒构建突变型(mut)XIST载体。将稀释后的HepG2细胞接种于12孔板，细胞融合至70%～75%时，利用Turbofect试剂将XIST-wt、XIST-mut载体分别与miR-133a mimic、mimic-NC质粒共转染至细胞中，48 h后，采用双荧光素酶报告实验测定细胞中荧光素酶活性。

1.3 CDDP作用条件的筛选HepG2细胞在含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养板置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，及时更换培养基并进行消化传代。细胞分别用0、5、10 μmol/L的CDDP处理48 h后收集，采用CCK-8试剂盒分析细胞活力。细胞用10 μmol/L的CDDP分别处理0、24、48 h后收集，CCK-8法分析细胞活力。

1.4 下调XIST表达对CDDP诱导的HepG2细胞活力和凋亡的影响

1.4.1实验分组 将HepG2细胞用10 μmol/L的CDDP处理48 h后，分两组，分别转染siRNA-NC、XIST-siRNA，按照Turbofect试剂说明书操作。

1.4.2细胞活力的测定 转染48 h后，弃上清，收集细胞，PBS洗3次，添加10 μL CCK-8工作液继续培养2 h，酶标仪读取450 nm处的吸光度(反映细胞活力)。重复3次。

1.4.3细胞中凋亡相关蛋白和Wnt/β-catenin通路蛋白的检测 转染48 h后，裂解液充分裂解细胞，提取总蛋白，按照75 V 30 min、120 V 1.5 h的程序进行SDS-PAGE，每孔上样50 μg。电泳结束后利用湿转仪将蛋白转到PVDF膜上，用50 g/L脱脂奶液室温封闭3 h，加Bax(1∶5 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶5 000)、Caspase-9(1∶5 000)、Wnt(1∶10 000)、β-catenin(1∶5 000)一抗室温孵育2 h，洗膜液清洗5 min×4次，加入稀释好的二抗(山羊抗兔IgG 1∶4 000，山羊抗鼠IgG 1∶5 000)室温摇床孵育1.5 h，TBST洗5 min×5次，滴加发光液曝光。使用Image J软件分析条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。重复3次。

1.4.4细胞中XIST表达水平的检测 采用实时荧光定量PCR法检测。Trizol法提取细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度。总RNA经反转录得cDNA，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR。预变性95 ℃10 min；变性95 ℃10 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃30 s，40个循环。以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt法计算XIST表达水平。重复3次。

1.5 下调miR-133a表达对CDDP诱导的HepG2细胞活力和凋亡的影响将HepG2细胞用10 μmol/L的CDDP处理48 h后，分两组，按照Turbofect试剂说明书操作，分别转染miR-133a抑制剂及抑制剂NC。48 h后进行细胞活力、凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin通路蛋白表达水平，以及miR-133a表达水平的检测，方法同前。重复3次。

1.6 上调XIST和miR-133a表达对CDDP诱导的HepG2细胞活力和凋亡的影响将HepG2细胞用10 μmol/L的CDDP处理48 h后，分别转染pcDNA-3.1(+)+mimic-NC、pcDNA-XIST+mimic-NC、pcDNA-XIST+miR-133a mimic，按照Turbofect试剂说明书操作。转染48 h后进行细胞活力、凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin通路蛋白表达水平、XIST和miR-133a表达水平的检测，方法同前，重复3次。

1.7 统计学处理应用SPSS 21.0进行统计分析。两组间各指标的比较采用两独立样本t检验；3组间细胞活力、凋亡相关蛋白表达水平，XIST、miR-133a表达水平及Wnt/β-catenin通路蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 XIST和miR-133a靶向关系的验证miRanda预测XIST和miR-133a有结合位点，结果见图1。双荧光素酶报告实验结果(表2)显示，XIST-wt和miR-133a mimic共转染细胞的荧光素酶活性降低，而XIST-mut与miR-133a mimic共转染细胞的荧光素酶活性无明显变化，提示两者存在靶向关系。

图1 XIST与miR-133a结合位点的预测

表2 双荧光素酶报告实验结果(n=3)

2.2 CDDP作用条件的筛选由表3和表4可以看出，10 μmol/L的CDDP处理48 h后HepG2细胞活力降低，后续实验条件设定为10 μmol/L的CDDP处理HepG2细胞48 h。

表3 不同浓度CDDP处理48 h后HepG2细胞活力测定结果

表4 10 μmol/L的CDDP处理不同时间后HepG2细胞活力测定结果

2.3 下调XIST后CDDP诱导的HepG2细胞活力和凋亡能力的变化见表5。与siRNA-NC组比较，XIST-siRNA组Bax表达降低，Bcl-2表达升高；Caspase-3、Caspase-9、Wnt和β-catenin蛋白表达降低；细胞活力升高(P<0.05)。提示下调XIST表达可以提高CDDP诱导的HepG2细胞的活力，抑制凋亡，并抑制Wnt/β-catenin通路激活。

表5 siRNA-NC和XIST-siRNA组细胞活力、凋亡相关蛋白、Wnt/β-catenin通路蛋白和XIST表达水平的比较(n=3)

2.4 下调miR-133a后CDDP诱导的HepG2细胞活力和凋亡能力的变化见表6。与抑制剂NC组比较，miR-133a抑制剂组Bax蛋白表达上升，Bcl-2蛋白表达下降；Caspase-3、Caspase-9、Wnt和β-catenin蛋白表达升高；细胞活力降低(P<0.05)。提示下调miR-133a表达可以降低CDDP诱导的HepG2细胞的活力，促进凋亡，激活Wnt/β-catenin信号通路。

表6 抑制剂NC组和miR-133a抑制剂组细胞活力、凋亡相关蛋白、Wnt/β-catenin通路蛋白和miR-133a表达水平的比较(n=3)

2.5 同时上调XIST和miR-133a后CDDP诱导的HepG2细胞活力和凋亡能力的变化见表7。与pcDNA-3.1(+)+mimic-NC组相比，pcDNA-XIST+mimic-NC组Bax、Caspase-3和Caspase-9、Wnt和β-catenin蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达下降，细胞活力升高(P<0.05)。与pcDNA-XIST+mimic-NC组相比，pcDNA-XIST+miR-133a mimic组Bax、Caspase-3、Caspase-9、Wnt和β-catenin蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，细胞活力降低；与pcDNA-3.1(+)+mimic-NC组比较，细胞活力、凋亡相关蛋白表达水平无明显变化。

表7 3组细胞活力、XIST、miR-133a、凋亡相关蛋白、Wnt/β-catenin通路蛋白表达水平的比较(n=3)

3 讨论

LncRNA与人类肿瘤关系密切，在肿瘤发生和化疗耐药过程中起重要作用[10]。越来越多的研究[11-13]表明LncRNA通过靶向miRNA发挥对肿瘤的调控作用。LncRNA XIST作为miR-101的分子海绵，可以通过调节EZH2的表达来调节胃癌进展[14]。本研究利用生物信息学软件miRanda预测到XIST和miR-133a有结合位点，经双荧光素酶报告实验验证，证实XIST与miR-133a存在靶向关系。miR-133a在癌症进程中和化疗耐药中发挥重要作用。在膀胱癌中，miR-133a靶向TAGLN2发挥抑癌作用[15]。miR-133a低表达是食管鳞癌患者预后的预测因子[16]。在结直肠癌中，miR-133a也发挥了明显的抑癌作用。

本研究对XIST在肝癌HepG2细胞CDDP耐药过程中的作用和可能的机制进行了分析。我们发现10 μmol/L的CDDP处理48 h后HepG2细胞活力降低，因此将实验条件设定为10 μmol/L的CDDP处理HepG2细胞48 h。后续实验结果显示，利用siRNA下调XIST表达后，CDDP诱导的HepG2细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9和通道蛋白Wnt、β-catenin表达降低，凋亡相关蛋白Bcl-2表达和细胞活力升高，提示下调XIST表达能够抑制CDDP诱导的HepG2细胞凋亡；利用抑制剂下调miR-133a表达后，CDDP诱导的HepG2细胞Bax、Caspase-3、Caspase-9和Wnt、β-catenin蛋白表达升高，Bcl-2表达和细胞活力降低，提示下调miR-133a表达能够促进CDDP诱导的HepG2细胞凋亡。与未调节的对照组比较，同时上调XIST和miR-133a表达后，CDDP诱导的HepG2细胞凋亡相关蛋白表达、细胞活力未发生明显变化。研究结果提示XIST可能通过调节miR-133a-Wnt/β-catenin轴，从而影响HepG2细胞对CDDP的敏感性，但具体作用机制还需要进一步深入研究。

综上所述，XIST可能通过miR-133a-Wnt/β-catenin轴调控CDDP诱导的肝癌细胞凋亡。XIST有可能成为肝癌治疗的靶点。