香蕉枯萎病和健康植株根际土壤细菌群落结构差异对比分析

番华彩，魏 薇，曾 莉*，徐胜涛，李 舒，郭志祥，郑泗军

(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；2.昆明学院农学与生命科学学院/云南省都市特色农业工程技术研究中心，云南 昆明 650214)

【研究意义】香蕉枯萎病是一种毁灭性的土传真菌病害，俗称香蕉黄叶病或巴拿马病，由尖孢镰刀菌古巴专化型 (Fusariumoxysporumf.sp.cubense) 侵染导致维管束坏死，造成香蕉的减产或绝收[1-3]。香蕉产业是云南的支柱性产业，是大边疆、少数民族农民增收致富的重要途径[4]。2009年，香蕉枯萎病在云南首次发现，目前在云南各香蕉主产区均有不同程度地发生，已严重威胁云南香蕉产业的可持续发展[5]。【前人研究进展】作物土传病害的发生主要是由于土壤中微生物群落结构变化引起[6]，土壤中细菌的群落结构组成直接影响细菌的功能多样性，并影响土传病害的发生和发展[7-9]。关于香蕉枯萎病在土壤微生物类群方面的研究主要集中于不同香蕉品种、轮连作及拮抗菌施用对植株根际微生物类群的影响等方面[10-16]。云南香蕉在根际土壤细菌多样性及群落结构方面的研究，特别是香蕉枯萎病和健康植株的根际土壤细菌群落差异对比尚未见报道。【本研究切入点】选取2种类型的香蕉植株根际土壤，研究香蕉枯萎病感病植株与健康植株根际土壤细菌群落结构多样性及其差异，探索微生物群落结构与香蕉枯萎病之间的关系。【拟解决的关键问题】研究明确香蕉枯萎病与健康植株根际土壤细菌群落结构组成丰度及差异，探索香蕉枯萎病发生的微生态机制，优化根际土壤微生物微群落结构，为其香蕉枯萎病的后续生态防控提供新策略。

1 材料与方法

1.1 样品采集

云南省玉溪市元江县属于干热河谷红河流域，气候类型为低纬度高原亚热带季风气候，最高海拔2580 m，最低海拔327 m，年平均气温23.8 ℃，终年无霜。选择元江县香蕉种植基地(北纬23°35'19″N，101°59′29″E，海拔为380 m)进行样品采集，基地土壤为砖红壤沙质土，种植香蕉品种为桂蕉，生育期为抽蕾期；在香蕉枯萎发病率约为5%～8%的地块，分别采集香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)2种类型香蕉植株根际土壤。

2018 年 11月使用5点取样法随机采集香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)植株根际土壤样品，每个处理5次重复，用土壤采集器采集0～10 cm 土壤，收集附着在根系上的土壤作为根际土壤，混匀后用聚乙烯无菌袋密封(自封袋)置于冰盒中立即带回实验室，捡出根须、石子等杂质，得到5份香蕉枯萎病植株根际土壤样品(FB:YJA，YJC，YJEA，YJEB，YJEC)，5份健康植株根际土壤样品(CK:YJH，YJI，YJLA，YJLB，YJLC)，共计10份土壤样品，置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2 土壤微生物基因组DNA提取及检测

参照FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)的使用方法，对土壤样品提取总DNA。使用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000 (Thermo Scientific，美国) 检测土壤样品总DNA浓度与纯度后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 PCR扩增及高通量测序

利用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌的16 S rRNA进行V3～V4区的PCR扩增。扩增产物送至上海美吉生物科技有限公司在Illumina Miseq平台上进行高通量测序。

1.4 数据处理和分析

运用QIIME(Uparse)8.0软件对Illumina Miseq测序所得原始数据进行扩增序列处理，在97%相似性水平上进行OTUs[17]分类(Operational taxonomic units) 划分，根据样本间Unifrac距离矩阵进行主坐标分析 (PCoA)[18]，采用R的pheatmap package[19]绘制热图。使用多变量方差分析(PERMANOVA)通过 R(v.3.2.5)中的程序包(v.2.3-5)测试样本间的差异。通过t-test 检验样本间的显著性，并使用单因素方差分析(ANOVA)获得多组的显著性。使用Mothur软件，对门和属水平上的细菌群落组成结构差异进行Lefse分析(P< 0.05)。运用R软件分析各样本 (组) OTU 数量，并通过 Venn 图呈现各样本 (组) OTU比例。

2 结果与分析

2.1 高通量测序数据分析

通过对香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)植株根际土壤的10个样品进行16 S rRNA 基因的 V3～V4 区扩增测序，共得到420 084条有效序列。香蕉枯萎病和健康植株根际土壤中包含的 OTU 数目分别是3432和2988个。根据各样本 (组) 的 OUT数目，通过Venn 图呈现香蕉枯萎病和健康植株样品的 OTU数目组成比例(图 1)，香蕉枯萎病和健康植株共有2854个OTU，发病组特有的有578个，对照组特有的有134个，其余为样品间两两共有。通过随机抽样的序列数与其对应的 OTU 数目构建香蕉枯萎病和健康植株根际土壤的细菌稀释曲线(图2)， 10个香蕉植株根际土壤样品的稀释曲线平缓， 2种类型香蕉植株根际土壤样品取样合理，根际土壤样品的细菌群落能够得到体现。

2.2 土壤细菌群落α多样性分析

通过细菌群落α多样性分析，比较香蕉枯萎病和健康植株的土壤细菌多样性差异。香蕉枯萎病植株的Ace指数和Chao1指数较健康植株的高，香蕉枯萎病植株细菌多样性较丰富，香蕉枯萎病植株和健康植株的细菌α多样性差异显著(P<0.05)；在均匀度上，香蕉枯萎病植株根际土壤细菌的Shannon 指数高于健康植株，而Simpson 指数低于健康植株，差异显著。

2.3 香蕉植株根际土壤细菌群落结构组成

通过使用QIIME 软件对10个香蕉植株根际土壤样品进行分析，门水平上，共有 34 个细菌类群，其中11个最大丰度的物种丰度柱形图(图3)表明，变形菌门 (Proteobacteria)为优势菌群，占细菌总数的 31.0%～46.5%，其它优势菌群依次为厚壁菌门(Firmicutes, 12.8%～22.6%)，放线菌门 (Actinobacteria, 9.9%～19.8%)，酸杆菌门 (Acidobacteria, 3.6%～12.2%)，绿弯菌门 (Chloroflexi, 4.1%～10.3%)，芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes, 3.5%～5.9%)，髌骨细菌 (Patescibacteria, 1.4%～2.1%)，拟杆菌门(Bacteroidetes, 1.1%～2.0%)，棒状杆菌 (Rokubacteria, 0.1%～2.4%)。优势门菌群中，厚壁菌门丰度健康植株较发病植株高，棒状杆菌丰度发病植株较健康植株高。属水平上，共有 513个细菌类群，丰度排名前 18的物种相对丰度柱形图见图4，香蕉枯萎病与健康植株的细菌群落组成有一定同源性，但细菌群落结构及丰度组成差异明显。芽胞杆菌属 (Bacillus, 9.5%)、芽单胞菌属 (Gemmatimonadaceae, 4.0%)、鞘脂单胞菌属 (Sphingomonas, 3.6%)和朱氏杆菌属 (Chujaibacter, 2.7%)为香蕉枯萎病植株根际土壤中的优势属。健康植株根际土壤中的优势属为芽胞杆菌属 (Bacillus, 16.6%)、朱氏杆菌 (Chujaibacter, 8.1%)、芽单胞菌属 (Gemmatimonadaceae, 3.0%)和鞘脂单胞菌属 (Sphingomonas, 2.2%)。优势属菌群中，芽胞杆菌属、朱氏杆菌属的丰度健康植株明显高于枯萎病植株，而芽单胞菌属和鞘脂单胞菌属的丰度比率低于枯萎病植株。

2.4 细菌菌群群落组成聚类分析

在属水平上，使用 R 软件，对于10个样品中丰度前50的细菌菌群绘制了Heatmap 热图聚类分析，分析了香蕉枯萎病和健康植株的根际土壤细菌群落的聚类热图(图5)。10个样品的细菌群落组成聚类为2个大的分支，香蕉枯萎病植株5个样品和健康植株的5个样品基本各为1个分支，香蕉枯萎病和健康植株的细菌群落组成结构有明显差异。芽胞杆菌属(Bacillus)在香蕉植株根际土壤中均为优势菌群，丰度大小健康香蕉植株(CK)>香蕉枯萎病植株 (FB)；朱氏杆菌属 (Chujaibacter)在健康香蕉植株根际土壤中为优势菌群，芽单胞菌属(Gemmatimonadaceae) 在发病香蕉植株根际土壤中为优势菌群。为了观察微生物群落结构变化，进行了PCA分析(图6)，从主坐标分析 (PCA) 图可看出，香蕉植株根际土壤细菌群落结构组成有明显变化，香蕉枯萎病和健康植株的细菌群落组成分离明显，健康香蕉植株的细菌群落在右边的轴上与香蕉枯萎病植株细菌群落能明显区分开，差别突显，同组的土壤样品具有相似的细菌群落结构。

2.5 细菌群落组成结构差异分析

为进一步分析香蕉枯萎病和健康植株的细菌群落组成结构差异，使用Mothur软件，对门和属水平上最大丰度前20的细菌菌群进行了Lefse分析(P<0.05)。从图7可以看出，门水平上(图7-A)，在香蕉根际土壤中最大丰度前20的细菌菌群中，香蕉枯萎病和健康植株的细菌群落组成结构有5个门差异显著，根据丰度大小依次为厚壁菌门 (Firmicutes)，棒状杆菌门 (Rokubacteria)，硝化螺旋菌门 (Nitrospirae)，Latescibacteria和Dadabacteria。厚壁菌门在健康植株中的丰度比例较高，但棒状杆菌、硝化螺旋菌门丰度比率低于枯萎病植株；属水平上(图7-B)，芽胞杆菌属 (Bacillus)，朱氏杆菌属 (Chujaibacter)，土壤链霉菌属 (Streptomyces)，伴伯克氏菌属 (Paraburkholderia)和Rokubacteriales等5个属的组成结构在香蕉枯萎病和健康植株中差异显著。芽胞杆菌属 (Bacillus)、朱氏杆菌属 (Chujaibacter)、土壤链霉菌属 (Streptomyces)和伴伯克氏菌属 (Paraburkholderia)在健康植株中的丰度比例高于香蕉枯萎病植株。

3 讨 论

生态系统中的微生物多样性丰富，在大自然的生物多样性中具有重要的生态功能[20]，土传病害的发生与植株根际土壤微生物数量及群落结构有密切关系[6]，土传病原菌作为土壤微生物的一种，其种群必然受到土壤微生物多样性的影响。研究结果表明,香蕉枯萎病和健康植株根际土壤细菌多样性及群落结构和组成差异显著，土壤细菌多样性香蕉枯萎病植株高于健康植株，陈波等研究也有相同结果[21]，但与欧阳娴[13]、林威鹏[14]等报道不一致，这可能与香蕉种植区域有关。变形菌门 (Proteobacteria)、厚壁菌门 (Firmicutes)、放线菌门 (Actinobacteria)和酸杆菌门 (Acidobacteria)等为香蕉植株根际土壤中的主要优势门菌群，黄珍[12]、周登博[15]、沈宗专[16]、Janssen[22]也有相同的研究结果。研究认为，属水平上，香蕉枯萎病和健康植株的根际土壤中有5个菌群差异显著，依次为芽胞杆菌属 (Bacillus)，朱氏杆菌属 (Chujaibacter)，土壤链霉菌属 (Streptomyces)，伴伯克氏菌属(Paraburkholderia)和Rokubacteriales；其中，芽胞杆菌属 (Bacillus)、朱氏杆菌属 (Chujaibacter)、土壤链霉菌属 (Streptomyces)和伴伯克氏菌属 (Paraburkholderia)健康植株的丰度比例高于香蕉枯萎病植株，芽胞杆菌属 (Bacillus)和朱氏杆菌属 (Chujaibacter)在香蕉植株根际土壤中属于优势菌群。芽胞杆菌属是厚壁菌门的一大类细菌，在不利于生存的环境条件下具较强抗逆性[23]，属于有益细菌。研究结果表明，优势菌属芽胞杆菌属 (Bacillus)在健康植株的根际土壤中丰度比例高于香蕉枯萎病植株，且差异显著。这可能是芽胞杆菌属对致病菌具有抵抗抑制作用，刘波[23]和杜贞娜[24]等研究也有相同结果。土壤链霉菌属于放线菌门，是放线菌的次生代谢产物，对尖孢镰刀菌等具有抑菌拮抗活性作用[25-26]，本研究土壤链霉菌在健康植株中的丰度比例高于枯萎病植株，在土壤中大量存在的土壤链霉菌可能抑制了枯萎病菌。研究结果还显示，伴伯克氏菌属 (Paraburkholderia)在健康植株中的丰度比例高于香蕉枯萎病植株。可能是由于伴伯克氏菌属能够促进健康植株对磷素的吸收与利用[27-29]，继而提高作物的抗逆性。

4 结 论

香蕉枯萎病和健康植株根际土壤细菌群落结构在一定程度上具有同源性，但部分菌群在2种类型植株根际土壤中的组成丰度有显著差异。门水平上，厚壁菌门 (Firmicutes)，棒状杆菌门 (Rokubacteria)，硝化螺旋菌门 (Nitrospirae)，Latescibacteria和Dadabacteria等5个菌群差异显著；属水平上，芽胞杆菌属 (Bacillus)，朱氏杆菌属 (Chujaibacter)，土壤链霉菌属 (Streptomyces)，伴伯克氏菌属 (Paraburkholderia)和Rokubacteriales等5个属差异显著。