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似鲇高原鳅LEAP-2基因序列特征及表达分析

2021-12-14宋明江陈叶雨吴晓雲赖见生

西南农业学报 2021年9期
关键词:氏菌抗菌肽侵染

宋明江,陈叶雨,吴晓雲,刘 亚,龚 全,赖见生

(四川省农业科学院水产研究所,四川 成都 611731)

【研究意义】似鲇高原鳅(Triplophysasiluroides)属鲤形目(Cypriniformes),鳅科(Cobitidae),条鳅亚科(Nemachilinae),高原鳅属,主要分布于青海、四川、甘肃的黄河上游[1]。似鲇高原鳅是中国特有的冷水性鱼类,对高原环境有着极强的适应性,是体型最大的一种鳅科鱼类[2]。似鲇高原鳅是黄河流域的一种重要经济鱼类,近年来,由于非法捕捞及生态环境的恶化,其野生资源量发生了严重的下降,已作为易危(vulnerable, VU)物种被列入《中国濒危动物红皮书》[3]。近年来, 似鲇高原鳅的人工繁育相继取得了成功,在一定程度上弥补了种质资源的不足。而在高密度人工繁育过程中,似鲇高原鳅出现疾病频发、大面积死亡的现象,严重威胁其后续育种工作[4]。抗菌肽广泛分布于上皮细胞表面,能抵御细菌、真菌、病毒及寄生虫的入侵,同时还具有中和内毒素、趋化免疫细胞、诱导血管生成、免疫调节及伤口修复等其他免疫活性[5]。与抗生素相比,抗菌肽作为一类小分子多肽,有着广谱的杀菌功能,其直接作用于细菌细胞膜,不会使细菌对其产生抗性[6]。因此,对抗菌肽的研究将在水产养殖疾病控制等领域有着重要的应用价值。【前人研究进展】肝脏表达抗菌肽2 (Liver-Expressed Antimicrobial Peptide-2, LEAP-2)是2003年首次从人类血液中分离的一种新抗菌肽[7],对革兰氏阴性、阳性菌具有广谱抗菌活性。目前,对达氏鲟(Acipenserdabryanus)[8]、金鲳(Trachinotusovatus)[9]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[10],弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)[11]、鮸(Miichthysmiiuy)[12]、鲤鱼(CyprinuscarpioL.)[13]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[14]和香鱼(Plecoglossusaltivelis)[15]等多种鱼类的LEAP-2基因均有相关研究。【本研究切入点】目前,对似鲇高原鳅的研究主要集中于人工养殖技术、地理种群遗传多样性分析及分子标记的开发等,对似鲇高原鳅疾病方面的研究仅限于病原微生物的分离,有关抗菌肽及其免疫调控等的研究还处于空白阶段。【拟解决的关键问题】本研究首次从似鲇高原鳅中分离出LEAP-2基因,分析其序列特征和系统进化的关系,并研究其在健康组织和细菌侵染下的组织表达特征,为似鲇高原鳅抗菌肽的应用和疾病防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用似鲇高原鳅采集于四川巨海渔业科技有限公司养殖基地,所有实验用鱼在处理前均用循环水养殖系统暂养2周。用于组织分布和细菌侵染实验的鱼为人工繁殖的子一代,平均体重24.6 g。攻毒实验选取的迟缓爱德华氏菌菌株取自四川省农业科学院水产研究所分子实验室。

1.2 基因序列分析

似鲇高原鳅LEAP-2基因cDNA序列从前期对似鲇高原鳅进行的转录组测序数据库中获得[16]。基因开放阅读框ORF使用软件Vector NTI 10.3.0分析。信号肽预测使用SignalP 5.0在线网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。基因同源性查找及同源基因使用NCBI在线网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行下载。似鲇高原鳅与其余物种LEAP-2相应氨基酸序列的多重比对利用软件ClustalX进行,序列多重比对图使用DNAMAN绘制。使用Mega 6软件中的Neighbor-joining法构建不同物种LEAP-2的进化树。

1.3 组织表达分析

选取3尾健康的似鲇高原鳅,用于检测LEAP-2基因的组织分布情况。似鲇高原鳅用MS-222麻醉后,分别分离鳃、肾脏、肝脏、肌肉、胃、脑、肠道、脾脏、皮肤、眼睛和心脏共11个组织,速冻于液氮,随后转移至-80 ℃冰箱保存,用于提取RNA。总RNA使用TRIzol试剂进行提取,RNA质量通过琼脂糖凝胶电泳进行初检,其纯度和完整度通过超微量分光光度计进行检测分析。质量合格的RNA使用Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser (Takara, 日本)。

1.4 细菌侵染下LEAP-2基因的表达量检测

将保存的迟缓爱德华氏菌进行复苏并培养至生长对数期,调至终浓度为1.6×106CFU/mL,每尾鱼注射200 μL的菌液。分别于细菌注射后0,12,24,48,72和96 h共6个时间点采集似鲇高原鳅皮肤、鳃、肠道、肾脏、肝脏和脾脏6个组织进行液氮速冻并保存,每个时间点选取3条鱼作为重复。

1.5 实时荧光定量PCR

LEAP-2基因的时空表达通过实时荧光定量PCR进行。PCR扩增体系为20 μL,包括10 μL TB Green Premix ExTaqTMII (Takara, 日本),4 μL 20倍稀释后的cDNA模板,上下游特异性引物各1 μL(表1)和4 μL PCR级灭菌水。PCR扩增体系如下:98 ℃预变性3 min;98 ℃变性5 s,59 ℃退火10 s,72 ℃延伸15 s,40个循环;最终70~95 ℃获取熔解曲线。内参基因选取β-Actin,采用2-ΔΔCt法计算样品中LEAP-2基因mRNA的相对表达量,每个样本重复3次。

1.6 数据分析

在迟缓爱德华氏菌攻毒实验中,以未注射细菌的个体为对照(0 h),使用SPSS 19.0软件进行显著性分析。基于单因素方差分析基础上,采用Turkey多重比较法对攻毒组和未攻毒组之间的差异进行检验,P< 0.05时为显著差异。

表1 LEAP-2基因荧光定量PCR检测所用引物

2 结果与分析

2.1 似鲇高原鳅LEAP-2序列及系统进化分析

似鲇高原鳅LEAP-2cDNA序列为2253 bp,其中5’非编译区(UTR)为270 bp,3’非编译区为1698 bp,3’UTR区域有明显的多聚腺苷酸化信号AATAAA序列(图1)。开放阅读框为285 bp,编码94个氨基酸。信号肽预测结果显示LEAP-2信号肽包含28个氨基酸残基。将似鲇高原鳅和其他鱼类的LEAP-2氨基酸序列进行比对(图2),序列相似性依次如下:西藏高原鳅(Triplophysatibetana, 95.74%),大鳞泥鳅(Misgurnusmizolepis, 80.85%),团头鲂(Megalobramaamblycephala, 77.66%),白甲(Onychostomamacrolepis, 77.66%),抚仙金线鲃 (Sinocyclocheilusgrahami, 77.66%),草鱼(Ctenopharyngodonidella, 76.60%),安水金线鲃(S.anshuiensis, 75.53%),唇(鱼骨)(Hemibarbuslabeo, 72.34%)和鲤鱼(Cyprinuscarpio, 72.34%)。

采用Mega 6绘制系统进化树(图3),似鲇高原鳅的LEAP-2与西藏高原鳅LEAP-2聚在一支,置信度为99%。似鲇高原鳅与西藏高原鳅LEAP-2与其余鱼类LEAP-2基因聚为一个大的分支,而哺乳动物人和小鼠LEAP-2聚在另一分支。

2.2 LEAP-2在不同组织的表达水平

LEAP-2在健康似鲇高原鳅的鳃、肾脏、肝脏、肌肉、胃、脑、肠道、脾脏、皮肤、眼睛和心脏共11个组织中均有表达(图4),但表达水平不一。其中,LEAP-2在似鲇高原鳅肝脏中的表达量最高,是在鳃中表达量的2000多倍。其次为心脏和皮肤,在脑和鳃中表达量最低。

2.3 迟缓爱德华氏菌侵染作用下似鲇高原鳅LEAP-2表达量的变化

在迟缓爱德华氏菌作用下,似鲇高原鳅LEAP-2mRNA表达量在各免疫组织中呈现出不同的变化趋势(图5)。在粘膜相关组织皮肤、鳃和肠道中,细菌侵染后48 h,皮肤中的LEAP-2出现显著上调表达(P<0.05)。侵染72 h后,皮肤、鳃和肠道中的LEAP-2均出现显著上调表达(P<0.05)。细菌侵染96 h后,鳃组织中的LEAP-2恢复到原始表达水平,而皮肤和肠道中的LEAP-2仍显著上调表达(P<0.05)。在系统性免疫组织脾脏、肝脏和肾脏中,肝脏中的LEAP-2在细菌侵染24 h时显著上调表达(P<0.05),随后下降。脾脏中LEAP-2先下降表达,随后在侵染48 h和72 h时显著上调表达(P<0.05),在96 h时恢复到正常表达水平。肾脏中的LEAP-2在攻毒96 h上调表达(P<0.05)。

3 讨 论

本研究中,在似鲇高原鳅中鉴定出了LEAP-2序列,序列比对表明,该基因与其他鱼类的LEAP-2基因序列高度一致。本研究将似鲇高原鳅LEAP-2氨基酸序列在NCBI上进行BLAST检索分析,发现与其他鱼类的LEAP-2同源性在70%以上,说明硬骨鱼中LEAP-2序列保守度较高。似鲇高原鳅LEAP-2基因在N端有一个信号肽序列,与其他物种的LEAP-2相同[8, 12-13, 17-19]。成熟肽C末端含有4种保守的半胱氨酸,可以形成2个二硫键,这是抗菌肽基因具有抗菌活性的关键结构。似鲇高原鳅LEAP-2成熟肽上富含带正电荷的氨基酸残基,可与微生物外膜上带负电荷的基团相互作用[20]。系统进化树分析结果显示似鲇高原鳅LEAP-2与其余鱼类LEAP-2基因聚为一个大的分支,与西藏高原鳅同源性最高,聚为一小支,进一步证实似鲇高原鳅LEAP-2是其他鱼类LEAP-2的同源物。

肝脏几乎是所有脊椎动物LEAP-2的主要表达组织。在不同水生动物中,LEAP-2的组织表达模式有所不同。例如,虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[21]和中华鳖(Pelodiscussinensis)[22]中的LEAP-2只在肝脏中表达,在其余组织中检测不到。而虹鳟LEAP-2也在其他组织中诱导表达,如肠组织和皮肤等。在其他物种例如草鱼[10],鮸[12],团头鲂[14],香鱼[15],条石鲷(Oplegnathusfasciatus)[23]和日本鳗鲡(Anguillajaponica)[24]中,LEAP-2转录本则存在于多种组织中,包括肝脏、脾脏、头肾和皮肤,肝脏为表达量最高的组织。在本研究中,LEAP-2转录本也普遍表达于似鲇高原鳅各检测组织,且在肝脏中高表达,高于表达量最低组织2000多倍,与达氏鲟LEAP-2的表达模式相似。研究结果表明,在正常情况下,似鲇高原鳅LEAP-2发挥生物学功能的场所主要集中在肝脏,而不是其他系统性免疫或粘膜免疫组织。

为进一步探索似鲇高原鳅LEAP-2在免疫应答反应中的功能,本研究用迟缓爱德华氏菌对似鲇高原鳅进行侵染,并研究LEAP-2在细菌侵染后的表达模式。研究结果表明,在迟缓爱德华氏菌作用下,各免疫组织中LEAP-2的表达量出现了显著性变化,且在不同免疫组织中呈现出不同的表达模式。首先,非常值得关注的是,除肝脏LEAP-2在侵染24 h后有小幅度上调表达外,其余时间段肝脏中的LEAP-2表达量与对照组相比都成下降趋势。肝脏为LEAP-2的主要表达组织,细菌侵染后出现下调表达推测肝脏里的LEAP-2可能转移至其他免疫组织,用于对抗细菌的侵染。肝脏中LEAP-2受到侵染后的表达模式变化同大鳞泥鳅(Misgurnusmizolepis)类似,其LEAP-2在迟缓爱德华氏菌作用后,也表现出先上升后下降的模式[25]。在粘膜免疫相关组织皮肤、鳃和肠道中,LEAP-2的表达量均出现显著上升,尤其是肠道组织的变化最为显著,与对照组相比在侵染后72和96 h后上升了几十倍,说明肠道在似鲇高原鳅对抗细菌侵染过程中发挥了重要作用。虹鳟LEAP-2在杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida) 作用后,皮肤和肠道中的LEAP-2被诱导表达[21]。在草鱼和团头鲂中,细菌诱导后大部分组织中均检测到LEAP-2表达上调。在其他硬骨鱼的不同组织中,在细菌攻毒后也观察到类似的LEAP-2mRNA水平的上调,因此,LEAP-2被认为有助于防御病原菌的入侵。皮肤、鳃和肠道为鱼类主要的粘膜免疫相关组织,细菌侵染后,LEAP-2在该类组织中的显著性上调表达,提示着似鲇高原鳅LEAP-2在机体粘膜免疫过程中的重要作用。为了充分了解LEAP-2在抵抗病原菌方面的作用,需要进一步通过外源表达获得重组蛋白,或通过化学合成,研究重组或合成的似鲇高原鳅LEAP-2的体外抗菌活性。

4 结 论

本实验首次从似鲇高原鳅中分离得到LEAP-2的cDNA序列,得到了其在鳃、肾脏、肝脏、肌肉、胃、脑、肠道、脾脏、皮肤、眼睛和心脏共11个组织的表达情况,并研究了细菌感染下,LEAP-2mRNA在不同组织中的表达状况,结果显示似鲇高原鳅LEAP-2参与到了机体对抗细菌侵染的免疫应答反应过程中,为以后似鲇高原鳅LEAP-2的应用奠定了理论基础。

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