大黄素增强紫杉醇对人小细胞肺癌细胞的体内抗肿瘤作用研究

张美珍 李登云 胡丹兰

肺癌是临床最为常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率高居所有肿瘤首位［1］。目前，肺癌的治疗手段主要有手术切除、化学治疗、免疫治疗、放射治疗等，但治疗效果仍未达到理想状态，且患者术后生存率较低［2］。紫杉醇是肺癌治疗常见的有效药，但易发生耐药，且不良反应多［3］。因而开展相关研究以寻求治疗肺癌的有效药或增强抗癌药的抗肿瘤作用具有重要的意义。近年来，研究发现大黄素能够有效抑制多种肿瘤疾病的发生发展［4-6］。本文旨在观察大黄素能否增强紫杉醇对肺癌细胞的抗肿瘤作用，为今后肺癌诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小细胞肺癌H466 细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司；大黄素购自东明格鲁斯生物科技有限公司，紫杉醇购自哈尔滨三联药业股份有限公司；青霉素、链霉素和胎牛血清均购自上海Sigma公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（批号：P0009）购自上海碧云天生物技术有限公司，CCK-8 试剂盒购自上海MedChem Express 公司；B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）（批号：ab224077）、BCL2-Associated X 的蛋白质（Bax）（批号：ab193573），及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（批号：ab181602）抗体均购自大连宝生物公司；Transwell 小室购自中国乐博生物公司。

1.2 实验方法 （1）细胞培养、用药与分组：取小细胞肺癌H466 细胞株复苏后，置入含10%胎牛血清的培养基培养，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中常规培养。取对数生长期的A549 细胞用于实验，将对数生长期细胞悬液浓度调整为（1×105个/mL）接种于96 孔板中，每孔加入100 μL，设置培养箱室温条件为37 ℃、湿度条件为5% CO2，培养24 h。配制不同浓度的大黄素溶液［7］，0 μmol/、10 μmol/、50 μmol/、100μmol/L，设置5 组复孔，分为空白组（0 μmol/L 大黄素+0 μmol/L 紫杉醇）、大黄素组（10 μmol/L 大黄素+0μmol/L 紫杉醇）、紫杉醇组（0 μmol/L 大黄素+10 μmol/L 紫杉醇）、低剂量组（10 μmol/L 大黄素+10 mol/L 紫杉醇）、中剂量组（50 μmol/L 大黄素+10 μmol/L 紫杉醇）、高剂量组（100 μmol/L 大黄素+10 μmol/L 紫杉醇），每组设置8 个复孔。（2）2CCK-8 法检测细胞增殖：分别在加入大黄素和紫杉醇预处理培养48 h后，以换液形式加入比例为10 ∶1 的CCK-8 试剂，孵箱继续培养2 h，设置酶标仪波长为450 nm，检测各组OD 值，计算癌细胞增殖率细胞增殖抑制率=（1-实验组OD 值/空白组OD 值）×100%。（3）流式细胞术检测细胞凋亡：在加入大黄素和紫杉醇预处理培养48 h 后，收集悬浮及贴壁细胞，1000 r/min 离心5 min，加入膜联蛋白V-FITC（AnnexinV-FITC）结合液重新悬浮细胞，避光室温孵育10 min，离心，弃上清，碘化丙啶（PI）冰盒中避光孵育10 min，加400 μL 缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。（4）Transwell 法检测细胞侵袭能力：在加入大黄素和紫杉醇预处理培养48 h 后，往Transwell 小室上层加入分别加入五组不同的培养细胞，下层加入500 μ含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，再培养24 h 后，弃去培养基，用棉签轻轻拭掉膜上的细胞，利用0.5%的结晶紫对上室底部细胞进行染色，并用棉签除去上室内侧的细胞，显微镜下观察细胞并统计细胞数量。（5）划痕实验检测细胞迁移能力：加入大黄素和紫杉醇预处理培养，过夜培养至形成单层细胞，用10 μL 的枪头在各组单层细胞上划横线，再用PBS 洗去因划线而脱落的细胞，分别拍照并记录0 h 和48 h 的细胞迁移情况，计算细胞迁移率，细胞迁移率=（0 h 划痕间隙距离-48 h 划痕间隙距离）/0 h 划痕间隙距离。（6）蛋白质免疫印迹（WB）检测A549 细胞凋亡蛋白表达：收集各组培养细胞，Trizol 法提取细胞总蛋白，使用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量试剂盒对提取的总蛋白进行定量测定，按比例加入4×蛋白上样缓冲液，95 ℃ 变性 5 min，置于-20 ℃ 保存备用。设置浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为 120 V 进行烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印。取氟乙烯膜用洗涤缓冲液洗膜5 min，共3 次，封闭、室温摇床孵育2 h。洗膜后先后加入一抗工作液（Bcl-2、Bax、GAPDH 抗体）和二抗工作液，进行一抗孵育和二抗孵育后，将新鲜配制的化学发光液滴加到氟乙烯膜表面，转移至成像分析系统暗箱中曝光，采集图像并分析。蛋白定量以相对光密度值代表蛋白相对表达量，以GAPDH 为内参进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，方差齐的多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；方差不齐采用Kruskal-wallis H 检验，两两比较采用Tamhane's T2 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的细胞增殖抑制率比较 不同剂量大黄素联合紫杉醇预处理48 h 后，空白组、大黄素组、紫杉醇组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞增殖抑制率分别（2.24±0.98）%、（6.43±1.21）%、（13.32±1.42）%、（23.91±4.50）%、（36.24±3.69）%和（57.37±9.52）%。与空白组比较，大黄素组、紫杉醇组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的细胞增殖抑制率均升（P＜0.05）；与大黄素组比较，紫杉醇组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的细胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；与紫杉醇组比较，低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；低剂量组、中剂量组和高剂量组比较，细胞增殖抑制率呈剂量依赖式升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组的细胞凋亡率比较 不同剂量大黄素联合紫杉醇预处理48 h 后，空白组、大黄素组、紫杉醇组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞凋亡率分别为（5.42±0.97）%、（7.94±1.23）%、（11.37±1.51）%、（16.82±1.67）%、（28.66±6.94）%和（35.54±6.98）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 流式细胞术检测细胞凋亡结果

2.3 各组A549 细胞凋亡蛋白表达水平比较 见图2、表1。

图2 Westerblot检测A549细胞凋亡蛋白表达结果

表1 各组A549细胞凋亡蛋白表达水平比较（±s）

表1 各组A549细胞凋亡蛋白表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与大黄素组比较，#P＜0.05；与紫杉醇组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05；与中剂量组比较，□P＜0.05

组别nBcl-2Bax空白组81.63±0.210.34±0.12大黄素组81.35±0.19*0.54±0.13*紫杉醇组81.14±0.19*#0.80±0.16*#低剂量组80.92±0.15*#△1.02±0.21*#△中剂量组80.66±0.13*#△▲1.23±0.22*#△▲高剂量组80.46±0.15*#△▲□1.51±0.18*#△▲□F 值52.08149.878 P 值＜0.001＜0.001

2.4 各组的细胞迁移率比较 不同剂量大黄素联合紫杉醇预处理48 h 后，空白组、大黄素组、紫杉醇组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的细胞迁移率分别（36.35±1.12）%、（29.37±3.69）%、（20.54±1.94）%、（13.36±1.81）%、（7.75±2.66）%和（3.57±1.07）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 细胞划痕实验结果

2.5 各组的侵袭细胞数比较 不同剂量大黄素联合紫杉醇预处理48 h 后，空白组、大黄素组、紫杉醇组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的侵袭细胞数分别（89.50±8.47）个、（88.50±7.78）个、（84.63±10.08）个、（61.50±6.48）个、（54.1±6.36）个和（15.88±3.80）个，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图4 各组侵袭细胞数（结晶紫染色×200）

3 讨论

肺癌按细胞类型可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌（SCLC）两大类型。SCLC 是起源于支气管黏膜或腺体的一类肺恶性肿瘤，占全部原发性肺癌的14.18%［8］，相较于非小细胞肺癌，SCLC 的恶性程度较高，生长速度迅速，倍增时间较短，易发生转移，且初期症状不明显，确诊时多已有远处转移病灶。目前，SCLC 除采用以化疗为主的综合治疗外，尚未找出理想的治疗方法。紫杉醇是广谱抗癌药物，适用于多种肿瘤疾病的治疗，然而长期使用会增加心血管毒性、肝脏毒性、脱发等不良反应的发生率，甚至会出现支气管痉挛性呼吸困难、荨麻疹和低血压现象，其中过敏反应发生率较高［9］。大黄素的化学名为1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌，是掌叶大黄根茎中重要活性成分，能够诱导大肠癌细胞内质网应激依赖性凋亡［10］，通过内质网应激和Tribbles 同源物3/核转录因子途径诱导肺癌细胞凋亡［11］，通过Wnt/β-Catenin 途径抑制上皮间充质转化抑制结肠癌细胞侵袭和迁移［12］。

本研究结果显示，大黄素组和紫杉醇组的细胞增殖抑制率明显高于空白组，且紫杉醇组高于大黄素组，说明大黄素和紫杉醇两种药物均有抑制癌细胞增殖的作用，紫杉醇效果更明显。另一方面，大黄素组与低剂量组设置的大黄素预处理浓度相同，多加紫杉醇的低剂量组的细胞增殖抑制率增大，提示大黄素与紫杉醇联用更能抑制癌细胞增殖，紫杉醇组与低、中、高各剂量组比较，由于各组设置的大黄素预处理浓度不一致，导致癌细胞增殖抑制率呈剂量依赖式升高，结果表明大黄素能增强紫杉醇抑制癌细胞增殖的能力，且大黄素浓度越高效果越明显。采用流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及WB 检测细胞凋亡蛋白表达水平发现，各组的细胞凋亡率、Bax 蛋白表达趋势与细胞增殖抑制率一致，Bcl-2 蛋白表达趋势与细胞增殖抑制率完全相反，Bcl-2 蛋白抑制癌细胞凋亡，而Bax 蛋白与Bcl-2 蛋白拮抗起到促进作用，因此两种检测方法均能反映细胞凋亡情况。研究显示，大黄素能增强紫杉醇促进癌细胞凋亡的作用，且大黄素浓度越高效果越明显。进一步检测细胞迁移能力发现，大黄素和紫杉醇均能抑制癌细胞迁移，紫杉醇效果比大黄素明显，联用效果更明显，亦有明显的剂量-效应关系，结果提示大黄素能增强紫杉醇抑制细胞迁移的作用，且大黄素浓度越高效果越明显。观察各组癌细胞侵袭个数，空白组、大黄素组和紫杉醇组的癌细胞侵袭数无明显差异，与上述3 组比较，低、中、高各剂量组的癌细胞侵袭数明显降低，且高剂量组低于低剂量和中剂量组，说明联用大黄素和紫杉醇能够降低癌细胞的侵袭能力，高剂量组更为明显。

综上，大黄素和紫杉醇均能抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进人肺癌A549 细胞凋亡，大黄素能够增强紫杉醇的抗肿瘤作用，抑制肿瘤效果与大黄素剂量密切相关。