多指标权重-响应面法优化葆肾1 号配制工艺研究

贾立波，卞振华（通讯作者）

（南京中医药大学无锡附属医院药学部 江苏 无锡 214071）

葆肾1 号方为我院肾内科临床实践经验方，在继承前辈江苏省名中医徐南甲、蓝华生主任在“脾虚”、“湿热伤肾”理论的基础上，提出了“肾络不固”是早中期慢性肾炎的基本病理机制，以益肾固络法治疗慢性肾炎，葆肾方是以益肾固络法治疗早中期慢性肾炎的基本方[1]，具有益肾和络、扶正祛邪、脾肾兼顾之功。基于本方在多年的临床使用中具有较好的疗效，未见不良反应，拟研发为院内制剂。本试验以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、绿原酸的转移率和浸膏得率作为综合评价指标，采用响应面法优选葆肾1 号的提取工艺，为该制剂的研发奠定基础。

1.仪器与材料

Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），DAD 二极管阵列检测器（美国Agilent 公司）；BSA224SCW 电子天平（德国Sartorius 公司）。毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸对照品（批号：111920-201606，110753-201817），均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯（美国Fisher Scientific公司），其他试剂均为分析纯。实验所用饮片均购自苏州天灵中药饮片有限公司。

2.方法

2.1 毛蕊异黄酮葡萄糖苷、绿原酸含量测定

2.1.1色谱条件 色谱柱：XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.2%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0 ～10 min，92%A；10 ～12 min，92%A →89%A；12 ～50 min，89%A；50 ～65 min，89%→80%A；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。采用波长切换法：0 ～26 min，326 nm，测定绿原酸；26 ～65 min，254 nm，测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷[3]。

2.1.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇定容，配制成相应的对照品溶液浓度为32 μg·mL-1、53 µg·mL-1。供试品溶液的制备：精密吸取1.5 mL 葆肾1 号样品，置于5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超声（300 W，40 kHz）10 min，静置放冷后加甲醇至刻度，混匀，过0.45 µm 微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。阴性样品溶液的制备：分别称取缺黄芪、缺石韦的全方饮片，照上述供试品溶液制备方法，制备阴性样品溶液。

2.2 提取工艺试验

2.2.1 Box-Behnken 响应面法试验设计[4]

按处方量称取全方饮片，共72.5 g，分别取17 份。运用Box-Behnken 设计模型，选取三个因素三个水平试验：A（煎煮时间：1、1.5、2 h）、B（煎煮次数：1、2、3 次）、C（加水量：8、10、12 倍）。按照设计方案，全方饮片浸泡30 min，煎煮后趁热过滤，合并滤液，浓缩至200 mL。

2.2.2 浸膏得率测定 将样品分别吸取25 mL 样品至已恒重的蒸发皿中，水浴加热至干，105 ℃干燥5 h，冷却30 min 后称重，105 ℃再干燥2 h，冷却后称重，直至恒重。

2.2.3 样品成分含量及转移率测定 分别精密吸取浓缩后的样品溶液1.5 mL，照“2.1.2”项下方法，制备供试品溶液，照“2.1.1”项下的色谱条件，记录峰面积，计算样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸含量，并计算响应面试验中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和绿原酸的转移率。

3.统计学分析

所得数据用Design-Expert8.0.6 软件进行的统计分析，P＜0.05 表示数据有统计学差异。

4.结果

4.1 响应面法分析和结果

为将所有指标综合为一个能反映总体效果的值，试验中引入多指标权重来考察提取工艺[5]，兼顾君臣药的主要贡献度、有效成分的可测性以及中药多成分发挥药效的特点，赋予各指标不同权重，赋予毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率、绿原酸转移率、浸膏得率分别为50%、30%、20%权重，见表1。

表1 试验方案与结果

上述实验所得数据用Design-Expert8.0.6软件进行响应面分析。以综合评分为响应值Y 分别对各因素X（自变量）进行多元线性回归方程拟合，回归方程Y = 83.50 ～0.20A+12.53B+3.01C-1.42AB-0.18AC-2.20BC+0.21A2-12.52B2+0.74C2。R2= 0.8730，adjR2= 0.7097。方差分析可知，模型的F= 5.35，P= 0.0190 ＜0.05，表明实验所采用的二次模型有统计学意义；失拟项P= 0.4377 ＞0.05，说明模型选择合适，因此可用该回归方程作为试验真实点对实验结果进行分析。由P值可知，因素B 提取次数的P= 0.0009 ＜0.01，说明提取次数对提取率有极显著影响，提取时间（P= 0.9332）和加水量（P= 0.2295）对提取率无显著影响（P＞0.05）。以综合评分结果最大值为目标，进一步进行模型预测，根据综合评分，其中最高为90.5932，其最优提取条件为：加水量12 倍，煎煮次数3 次（2.47），每次1 h。结合实际生产，节能减排，确定最佳提取工艺为加水量12 倍，煎煮次数2 次，每次1 h。

4.2 提取工艺的验证试验与结果

按最佳工艺制备样品，照上述方法测定，浸膏得率和毛蕊异黄酮葡萄糖苷、绿原酸转移率均较高，验证结果为该提取工艺可行和稳定，见表2。

表2 提取工艺验证试验结果（n = 3）

5.讨论

本实验选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷、绿原酸的转移率和浸膏得率作为提取工艺的评价指标，基于毛蕊异黄酮葡萄糖苷为本方黄芪的主要活性成分，且检测方法成熟、分离度好、专属性强，赋予其50%权重；绿原酸作为石韦的主要活性成分，赋予30%权重；充分考虑到本方作为复方中药制剂供临床使用，其药效物质基础为多成分共同作用，体现方剂其他配伍药材的评估，将浸膏得率赋予20%权重。利用综合评分多指标权重结合响应面法进行工艺优选，保证了提取工艺研究的可靠性和合理性。通过响应面法的回归分析和方差分析的结果，初步确定葆肾1 号的提取工艺条件，同时考虑到生产实际成本、能源消耗以及环境污染等因素，确定最佳提取工艺。