微流控技术在解决猪体外受精中多精入卵问题中的应用进展

刘芊萩, 陈强, 雷安民

(西北农林科技大学动物医学院， 陕西 杨凌 712100)

近年来，随着猪在人类生物医学研究及人类疾病模型中地位不断上升，胚胎工程技术不但在猪遗传育种领域的科研应用需求不断扩大，在生物医学研究及人类疾病模型领域的需求也更加迫切。鉴于猪体内胚胎研究的高成本，基于猪卵母细胞体外成熟培养(invitromaturation，IVM )、体外受精(invitrofertilization，IVF)、体外胚胎培养(invitroculture，IVC)获得的低成本体外胚胎成为试验研究的主要来源。与其他家畜如牛羊不同，猪体外胚胎多精受精率很高，这使得体外胚胎的发育能力大大降低，因此多精受精已经成为医学生物学利用猪胚胎的一个障碍。多精入卵是指2个或2个以上的精子进入同一卵母细胞的胞质中,导致多倍体合子的形成、早期胚胎发育夭折或发育异常。如今尚不能完全解释猪体外受精过程中出现的多精受精现象。为此探讨猪体外胚胎多精受精的原因，克服猪体外受精中多精入卵的发生成为当前的关键问题。

微流控芯片作为新兴的生物技术工具，已广泛应用于小分子分析、核酸分析、蛋白质分析等领域。Kricha等[1]首次采用微流控芯片实现了小鼠的体外受精，证明了微流控芯片在辅助生殖领域的可用性。近年来，微流控芯片在精子优选、卵母细胞培养、体外受精及早期胚胎培养等方面应用广泛。Clark等[2]首次证明，仿生微通道体外受精系统可以减少猪多精受精，增加胚胎数量，而不降低整体体外生产效率微流控技术的引入，有助于解决猪体外受精过程中多精入卵率较高的问题。本文总结了微流控技术在哺乳动物胚胎学研究中的应用，提出了将微流控技术应用于猪体外受精技术，目的在于解决并克服猪体外受精中存在的多精入卵，旨在为完善猪体外受精技术提供可行的解决方案，同时为人类医学辅助生殖技术的优化完善提供新思路。

1 多精受精的原因

猪的多精受精现象主要存在于猪体外受精过程中。在实际养猪生产中，猪的窝产仔数可以达到10左右，略低于每个情期的平均排卵数，说明正常发情过程中所排出的卵子大部分都是正常授精的。比对体内自然条件的受精过程与体外受精过程，导致猪体外受精过程中形成多精受精现象主要有3个原因：一是卵母细胞的成熟质量不及体内成熟卵；二是精子的体外获能不充分；三是体外受精环境不同于体内，导致受精过程出现异常。

1.1 卵母细胞成熟度影响受精过程

除了细胞质内物质积累外，卵母细胞成熟过程中，影响多精子入卵发生的因素主要有透明带反应、卵黄膜反应等，这些都与卵母细胞的细胞质成熟度相关。

在体外受精过程中，卵母细胞未成熟或过度成熟都会引起多精受精率的升高。皮质颗粒是卵母细胞特有的，用于阻止多精受精的细胞器，哺乳动物的皮质颗粒在未成熟卵母细胞和体外培养卵母细胞中的分布不同于在体内成熟的卵母细胞中的分布[3]，表明皮质颗粒的变化与卵母细胞的质成熟和核成熟有关。未成熟卵母细胞不能产生完整的皮质反应，主要是由于未成熟卵母细胞对精子进入产生的刺激不敏感，且内质网的数目过少，皮质颗粒分布不均匀，精子进入卵母细胞时，不能引起皮质颗粒的释放。而过度成熟的卵母细胞容易发生老化，会使皮质反应不能发生或反应不彻底，进而引起多精入卵[4]。

透明带反应是阻止多精入卵的重要环节，当精子进入透明带后，会引起皮质颗粒的释放，颗粒内容的释放引起透明带结构的改变，进而阻止后续精子的进入。因而，透明带结构的完整性与透明带的厚度将直接影响受精过程是否正常。在辅助生殖过程中，过多的人工操作常引起透明带的机械损伤，会导致多精受精的发生。精卵比例的增大会使受精过程中卵母细胞的皮质颗粒释放延迟，引起多精受精的产生。研究表明，多精受精率会随着精卵比的升高而升高[5]，因而筛选出具有优良品质的精子、降低精卵比有助于解决多精入卵的问题。

此外，卵母细胞的成熟质量较差时会使卵母细胞受精过程中发生第二极体滞留，实质是卵母细胞第二极体不能正常排出，从而导致受精卵中2个雌原核和1个雄原核的形成，最终能够形成多倍体。

1.2 精子原因导致体外受精胚胎的发育不良

由于体外受精不同于体内受精过程中精子在生殖道中的自然选择，所以相关研究或者临床应用中，常常采用人工方法对精子进行分选。目前常用的办法主要有：①常规精子分选技术，主要是指上游法结合离心清洗；②利用不同质量精子表面ζ电位的差异分选精子；③基于细胞流式分选系统的磁激活细胞分选系统；④基于透明质酸结合的精子分选；⑤基于电泳的精子分选；⑥依托运动精子细胞器形态学检查结果的精子分选；⑦基于微流体的精子分选[6]。

2015年，日本学者采用简单实用的摇摆受精系统，大大减少了猪体外授精的多精受精现象[7]。这些手段都是基于优良的高活性精子的特性将其从精子群体中分离出来，尽管能够提高体外受精的效率，但是否能够减少猪的多精受精现象，仍需进一步研究。

1.3 授精环境导致的多精受精

受精环境中的激素成分、物理条件等也会影响多精受精的产生。受精环境中孕酮水平与卵母细胞成熟状态密切相关，尤其是雌激素与孕酮的比值直接影响卵母细胞的发育。而黄体酮水平升高会减弱透明带的硬化程度，影响猪胚胎的形成[8-9]。培养基pH的改变会影响精子获能和顶体反应的结果，pH升高能够提高受精率，但会降低皮质颗粒的活力。一些培养基的添加剂如碳酸氢盐、肝素和咖啡因等，也在不同程度上影响多精受精的发生[10-12]。

2 微流控在胚胎工程中的应用

应用传统的辅助生殖技术效率低，且体外受精的临床环节会对母体造成身体伤害、情绪压力。因此，如何优化、改进卵母细胞和精子以及胚胎的质量评估技术，进而提高体外生殖成功率是推动辅助生殖技术发展的必要条件。

微流体芯片作为新兴的生物技术工具，可以对卵母细胞和胚胎等珍贵的细胞样本进行非侵入性的细胞质量评估，对辅助生殖中的精子样品进行高通量筛选。与使用培养皿、试管或培养基滴等经典体外方法相比，这些小体积和低雷诺数的芯片更接近授精和胚胎培养的体内环境，这一平台可以为改善体外受精和胚胎培养提供一种潜在手段。

2.1 微流控芯片在精子质量评估中的应用

辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)利用精子分选的方法从精液样本中筛选优质精子。目前使用的常规精子分选技术有密度梯度离心法、直接上游法和常规上游法。但这些方法离心步骤复杂，易产生活性氧，降低DNA完整性并损害精子。新型生物技术，如微流体、电泳、运动精子细胞器形态学检查和双折射减少了离心步骤，可以改善精子的筛选过程，获得完整性更高的DNA、正常形态和运动性的精子，从而改进人工授精结果。

微流控平台最早被用于改进辅助生殖技术中精子的质量评估环节，微流控平台特有的收缩性质以及可以创建复杂通道和储库网络的能力是评估运动精子活力的有用组合。早期装置没有整合活性流体流动，也没能在流经微流体通道期间利用流体的独特物理特性，但它们确实为精子质量评估提供了有潜力、可尝试的平台。近些年，随着设计和制造工艺的进步，微流体在精子优选中的应用也在增加。

微流控装置通常基于运动能力和形态对精子进行分选，集成减少了传统精子筛选步骤。微流体装置研究表明，回收的精子样本运动性几乎达到了100%，同时精子的形态也得到了改善[7]。另一项研究所设计的层流筛选装置基于精子活力进行筛选，出口处的精子活力从原始样本的76.21%增加到95.24%[13]。有研究分析了流速和培养基表面形态对精子速度和功能的影响。女性生殖道包含天然微槽和向外流动的液体，有助于将精子引导至卵子[14]，这些微槽和流动的液体有助于筛选出活力良好的精子。有研究模拟女性生殖道的结构设计了一种微流体装置，该装置将精子置于一端开口处，通过控制精子向另一端出口的流动，模拟精子在子宫微槽内的运动。结果显示，80%的精子以3 μL·min-1的流速对抗流动；此外，一旦精子进入微槽，就会被留在凹槽中并直线前进，没有凹槽的通道中精子倾向于在没有方向的情况下以曲线游泳，这一信息在将来可用于选择直线游动的精子[15]。

2.2 微流控芯片在体外胚胎生产中的应用

将微流体技术用于卵母细胞的体外成熟以及早期胚胎的培养时，需要设计可用于培养细胞的微流体装置。卵母细胞的体外成熟和胚胎培养要考虑的主要问题是如何提高实验最终的胚胎回收率，虽然在处理数十万或数百万个细胞时可以仅回收初始细胞群的一部分，但对于涉及卵母细胞和胚胎的研究，必然要求回收率达到100%。因此，微流控平台必须使回收过程可控和准确，同时不能改变微流体，有利于细胞培养的特性。此外，应用微流体的额外精力和成本投入必须通过配子或胚胎的显著收益来抵消，以证明该技术是可行的。目前，微流控平台已经开始接受胚胎学各个方面的初步测试，包括卵母细胞体外成熟(IVM)，体外受精(IVF)和胚胎培养(IVC)。

2.2.1微流控芯片在卵母细胞成熟中的应用

传统的体外卵母细胞成熟培养低效且昂贵，而使用微流控芯片进行体外卵母细胞成熟，可以降低成本和降低对卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)等疾病的健康风险。应用于卵母细胞体外培养的第一个微流控装置，微流体通道两侧是两个固定的培养基储库，结果显示，装置中的猪卵母细胞并未达到有效成熟(2% metaphase II， MII)。然而，当这些卵母细胞在PDMS(聚二甲基硅氧烷)装置中成熟时，与对照微滴相比，它们以明显更高的速率成熟(分别为2%和相对于MII的71%)[16]。这些研究在不同材料制造的类似设计装置中进行，最终所得结果差异显著，表明材料的选择对敏感的卵母细胞至关重要。

利用微流控通道中液体的可流动性，改进了传统的静态培养装置。一种利用磁力驱动的操纵器结合超声振动进行单细胞操作的微流体装置[17]，可以定向移动猪卵母细胞，并且在应用于不同实验目的时，可以进行程序修改。在此前，振动培养平台已被证明可以提高猪卵母细胞的发育能力，但这仅适用于体积较大的标准培养皿。因此，如何利用微流体的特性、设计出更接近于体内生殖道环境的培养平台，模拟体内的机械刺激和液体环境，是优化体外卵母细胞成熟体系的关键。

2.2.2微流控芯片在体外受精中的应用 因为精子的独立运动距离存在阙值，精子运动路径还可能受到装置轮廓的影响，而精子的活动特征和精子在装置中与卵母细胞的相互作用高度依赖于受精环境，体外受精成为了辅助生殖技术中相对困难的步骤。使用微流控芯片固定精子运动路线，限制精子数量，模拟体内受精环境，从而提高受精效率是胚胎仿生学研究的重要目的。

使用置于PDMS(聚二甲基硅氧烷)/硼硅酸盐微通道中的猪卵母细胞进行人工授精程序步骤，所得结果与对照微滴中的受精结果相比，该装置显著降低了多精入卵率，这得益于微流体装置的物理特性，可以更好地模拟体内环境[2]。同时，该微流体装置可用于限制卵母细胞暴露于精子的时间，因为精子不再局限于卵母细胞的附近，而是不断游过卵子。有研究在微流体微孔阵列装置上进行了受精实验，与先前的装置类似，平台由PDMS制成并且构造有入口和出口储蓄池，其使用重力产生动力。从每个储库引出的微通道连接到更大的微室，其中设有用于捕获单个卵母细胞的方形微孔，微孔深度可以在保留卵母细胞的同时去除细胞碎片及杂质。培养液和精子可以流过容纳卵母细胞的微孔，随后在其中与卵母细胞发生受精。这种装置与单孔微流控芯片相比，得到了相似的小鼠卵母细胞受精率(69.0%对71.4%)[18]。来自同一研究组的另一种设备，其设计不同，结合了多个程序步骤，也产生了有利的受精结果[19]。随着技术的发展，其他微流体装置还开发了将授精与其他程序步骤相结合的方法。

2.2.3胚胎体外培养 在已经进行的用于优化辅助生殖技术的研究中，微流控芯片在胚胎培养上的应用被证明是有益的。Raty等[20]使用微流体进行胚胎培养的初步报告表明，2细胞小鼠胚胎可以在静态微量培养基中培养至囊胚阶段。与30 μL对照微滴相比，在含有约500 μL培养基的微通道内培养，小鼠胚胎能够在24 h发育成更大的桑椹胚，在48～72 h形成更大的胚泡，以及在72～96 h产生更多的胚泡。然而，该研究没有评估对植入的影响。另有学者利用类似装置进行了后续实验，结果表明，体内衍生的4细胞猪胚胎可以培养成囊胚，之后进行胚胎移植并成功产出胎儿[21]。

近年来，学者们为了模拟体内环境培养胚胎，还开发了一种采用电介质(electrowetting on dielectric，EWOD)电润湿技术的新型数字化微流体装置。结果表明，用EWOD驱动的动态培养可以操作含有一个小鼠胚胎的单个液滴并培养至胚泡期，胚胎孵化胚泡的速率显著高于传统静态培养物(P<0.05)。从EWOD芯片收集胚胎并转移到假孕雌性小鼠体内，得到了健康胎儿，证明EWOD芯片提高了小鼠胚胎的发育能力[4,22]。

3 利用微流控技术解决多精入卵问题

针对前文所述的猪多精受精原因以及微流控芯片在胚胎体外生产中的应用优势，微流控技术能够很好地解决多精受精，原因有三，分别是控制卵母细胞的成熟度、精子的有效分选以及改善体外受精的环境。

3.1 微流控体系提高了卵母细胞的体外成熟质量

应用微流控体系进行卵母细胞的体外成熟，与对照组传统微滴培养法相比，应用微流控体系以明显更高的速率成熟(分别为2%和相对于MII的71%)[16]。其次利用微流控通道中液体的可流动性，改进了传统的静态培养装置。牛体外受精的研究显示，与静态成熟的卵母细胞相比，在微流控体系成熟的牛卵母细胞受到层流影响，大大改善了IVM后的胚泡发育[17]，卵母细胞成熟质量的提升无疑会大大减少多精入卵的机会。

3.2 微流控体系优化精子的筛选过程

与正常的体内受精相比较，体外受精中精子密度可能是影响多精受精的关键。而微流控体系能够改变受精过程中的精卵比例；维持相对稳定适宜的受精温度和pH，这些措施可以在一定程度上降低多精入卵率。随着对猪植入前胚胎发育调控的了解，以及新的分析方法和技术的出现，借助各种新型培养平台探索外界环境条件改变对胚胎的影响，有助于进一步改善体外受精系统。

在微流控芯片的开发研究过程中发现，微流控装置设计的通道结构可以产生动态流体的机械刺激，同时模拟体内微环境自分泌因子的分布，在微环境中的培养过程更类似于体内环境，因此能够更好地模拟精子与卵母细胞所在的生殖腔环境。通过设计与改造，有望消除引起猪体外生殖过程中多精受精产生的因素。同时，利用微流控芯片高通量进行精子筛选，并控制受精环境的精卵比，有助于降低多精入卵率。

利用微流控体系形成的层流效应筛选精子的微流体精子分选仪(microfluidic spermsorter，MFSS)已经被开发出来，可用于猪的IVF。在MFSS-IVF系统中使用公猪稀释精液进行受精后，正常受精指数(单精受精与初始卵母细胞数量比)比传统IVF更高，同时装置中受精卵母细胞的发育能力(胚泡形成能力)高于传统IVF。总之，在MFSS装置中的猪卵母细胞与精子的简短共培养提高了单精子受精的概率和胚胎的发育能力[23]。

4 微流控体系优化体外胚胎的培养

在过去的20年里，改善体外胚胎发育的研究中涉及最多的变量是培养基的化学组成，这一条件的改变有助于减少多精受精，提高辅助生殖的成功率。然而，在解决多精入卵问题的研究中，不仅需要考虑发育中胚胎的化学需求，其潜在的生理需求也是所要考虑的重要因素。卵母细胞和胚胎通过雌性生殖道的过程不仅使其浸泡于化学成分变化的液体，而且还为其提供了温和的机械刺激，这可能会影响卵母细胞和胚胎的发育。随着对植入前胚胎的理解得到改进，新的分析方法和技术相继出现，对于各种新型微流控培养平台的研究，显示出物理和机械环境改变可能进一步改善胚胎的体外发育。

4.1 基于静态培养的传统培养体系

在过去哺乳动物和非哺乳动物体细胞系、转化细胞系，配子和胚胎都是被培养在惰性材料中如玻璃或塑料聚合物。在这些细胞培养方法中，除了使用振动平台或轨道搅拌器的外力振动方式外，所有的培养环境均被认为是静态的。现阶段，静态的微流控芯片已经被开发用于胚胎培养，这些静态培养平台可以通过简单地改变培养基的体积和成分，或改变每个培养基的胚胎数量来产生不同的培养环境。

已经在实验室中使用的商业化产品是一种微孔芯片，这种装置可以对小鼠、猪和牛等动物的胚胎进行单独培养。这些隔离的孔相互之间可以产生微流体通道，以达到介质交换，这种连接的插入物可用于研究自分泌和旁分泌化合物对胚胎间的影响。这些微孔可以用PDMS精细地构建，这一结构能够形成有益胚胎发育的微环境。另外，这些微孔可以使用生物分子材料，例如透明质酸或氢氧化铵涂覆以形成水凝胶表面，这样更加接近发育中的胚胎在体内的环境[24]。

在静态培养条件下，微通道也可作为胚胎的培养装置，在微通道中胚胎可以发育至囊胚阶段。研究发现，在微通道培养72和96 h的胚胎分别观察到囊胚形成和孵化胚泡的发育。使用填充有培养基的玻璃毛细管是进行胚胎的微通道培养研究的另一种方法，这个系统还支持从合子到囊胚阶段的小鼠胚胎发育[25-26]。

虽然静态培养系统已经成功应用于卵母细胞的体外培养，但与体内环境相比，静态环境无法提供卵母细胞在子宫颈中所受到的挤压力及变化的液体环境，卵母细胞的成熟状态还不能得到完全控制。

4.2 基于动态培养的微流控体系

因为植入前胚胎在输卵管和子宫中的生长阶段是进行发育的最终环节，肌肉收缩和上皮细胞纤毛的运动使植入前体内胚胎不断移动，这会对发育中的胚胎产生机械性影响，这种运动也会改变细胞表面的化学物质梯度，可以形成胚胎周围环境的动态变化，这证明了动态培养体系的重要性。在静态培养条件下，由于胚胎分泌物或培养基成分耗竭，培养基中存在着化学浓度的变化，而动态培养平台可以破坏这些梯度，提供更接近体内生长环境的更均匀的环境。另外，动态的培养系统也为胚胎提供了一个流动的环境，不断更新培养基质和去除其代谢废物。通过现代微流控技术可以解决这一问题，该技术可以为细胞创建一个动态的培养环境。

有研究首次描述了使用基于注射器的泵来产生流动培养基的动态胚胎培养方案[27]。微通道位于储存池的底部，胚胎干细胞可以在微通道中静止培养以促进它们在注射器泵活化之前的贴壁[28]。通常将诸如胚胎的非粘附细胞移入紧邻微通道开口的储库底部，然后胚胎被动地进入微通道，并沿微通道向下滚动到微通道被半封闭的区域，此处形成屏障并且充当微通道中胚胎的停止点，然后可以使用注射器泵在微通道中固定的胚胎上产生受控流体，Hickman等[29]应用微流控体系使用这种系统来研究小鼠胚胎发育过程中微通道中流体流动的变化，研究开始强调流速、流动方式和胚胎周围流体动力的交互作用。

2007年，名为“子宫芯片”的微流控装置被开发制作，该装置将子宫内膜细胞与胚胎共培养在一个联通装置中。这种先进的系统已经被用来改善小鼠胚胎发育[30-31]。之后一种新的微流控装置被开发，用于对小鼠卵母细胞进行体外培养，并对成熟情况进行评价，该装置主要评估卵母细胞受精至囊胚期的发育情况及其谷胱甘肽含量。结果显示，被动和主动动态培养系统中，成熟中期Ⅱ期卵母细胞(MII)的百分率明显高于静态组，被动组和主动动态组的生发泡(GV)和退化卵母细胞的平均数目明显少于静态组，同时动态成熟卵母细胞中谷胱甘肽含量显著高于静态成熟卵母细胞[32]。研究显示，体外卵母细胞成熟的动态培养与静态培养条件相比，提高了卵母细胞的发育能力。

使用微流控装置也可以实现在大型微孔阵列中高效捕获单细胞的目的，当前生物测定大多数是基于大细胞群体，其在多细胞反应的过程中会失去重要的时间数据。这种捕获装置不依赖于细胞粘附，并且不需要庞大或昂贵的器具来将细胞保持在微孔中[33]。这一装置为之后的单个卵母细胞处理提供了操作基础，也可以进一步降低精卵比例，控制接触卵母细胞的精子数量。

动态培养系统的研究为解决多精入卵问题提供了新的方向，卵母细胞成熟过程中不同阶段所需的不同化学因子可以通过动态系统精确控制，注射泵及层流效应使卵母细胞所受外力更接近于体内。而光学仪器与芯片的结合实现了卵母细胞的成熟过程及发育情况的全程监控，从而可以选择最优成熟时期进行受精操作，有助于解决由于卵母细胞不完全成熟导致的多精入卵情况。

5 展望

微流控所具有的明显优势使其成为改良辅助生殖技术的潜在手段，其操作规模小，只需要少量的精子样本用于受精，而不会造成大量精子的浪费。同时该技术与生物光学的结合可以做到非侵入性的精子质量检测，减少筛选过程中的损失。微流控芯片采用的计算自动控制机程序可以实现不同时段胚胎发育情况的监测和显示，通过连续成像有助于进一步确认胚胎发育潜能。通过实现动态培养、胚胎单个捕获等操作，微流控芯片还为可能进行的卵母细胞后续处理提供了操作基础。该平台接近于体内受精与胚胎培养环境，并能方便地控制微观条件下的培养，为研究人员解决猪体外受精中出现的多精入卵现象提供了更多研究可能。

猪体外受精中的多精受精一直是相关领域的研究难点，借助微流控技术提供的实时精准监控评测技术，可能帮助解开猪多精受精的原因所在，为将来利用猪进行相关研究提供便利。但基于微流控技术的精子筛选及胚胎培养无法对大量样本进行操作，对于需要大量材料的实验，仍只能使用传统方法。同时微流控平台的复杂操作需要高度专业化的人员，在临床环境中对于设备操作和结果分析仍有许多限制因素，因而大多数微流体装置仍停留在临床试验阶段，在获得对ART影响结果前需要更多的信息，尚有许多困难等待解决，广泛应用仍需时日。