lncRNA KIZ-AS1通过调控miR-1290/CDC73轴抑制膀胱癌细胞增殖和迁移

鲁帅奇 杨凌博 秦帅锋 张 寒 孙建涛

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，致病因素包括抽烟、环境因素等[1,2]。膀胱癌患者男性多于女性，发生率随年龄增长逐渐增高[3]。膀胱癌患者复发比例和转移率较高，严重威胁患者生命健康[4]。长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)均是非编码RNA，参与调控肿瘤细胞的癌变、增殖、凋亡、迁移等过程，在肿瘤的发生和发展中起到关键作用[5,6]。miR-1290在口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、胃癌等多种肿瘤组织或血清中高表达，显著促进肿瘤细胞的生长和转移，与肿瘤患者的不良预后密切相关[7,8]。有研究显示，miR-1290在膀胱癌细胞中表现为促癌因子作用[9]。KIZ-AS1是近年来发现的lncRNA，由562个核苷酸构成，目前关于KIZ-AS1在膀胱癌组织中的表达、作用及与miR-1290的靶向关系未见报道。本研究旨在观察KIZ-AS1在膀胱癌组织和细胞系中的表达，探讨KIZ-AS1对miR-1290/CDC73轴的调控作用及对膀胱癌细胞增殖和迁移的影响。

材料与方法

1.临床标本：选取2017年9月～2020年12月郑州大学附属洛阳中心医院泌尿外科膀胱癌根治性手术切除37例癌组织和癌旁组织，所有患者术前均未行放疗和化疗，本研究经郑州大学附属洛阳中心医院医学伦理学委员会同意，患者均签署知情同意书。其中男性29例，女性8例，平均年龄为57.19±13.15岁；病理分级按照WHO(2004年)病理分级标准：1级7例，2级17例，3级13例；临床分期按照国际抗癌联盟(UICC)TNM分期标准：Ta～T125例，T2～T412例。所有组织术后立即于液氮中保存，所有标本均经笔者医院两名以上病理科医生确诊。

2.细胞与试剂：膀胱癌细胞系(RT-4、BIU-87、T24、5637)和膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)购自中国典型培养物保藏中心。KIZ-AS1慢病毒、阴性对照慢病毒、miR-1290 模拟物(mimic)、miR-NC mimic、pGL3-KIZ-AS1野生型质粒(KIZ-AS1-WT)与突变型质粒(KIZ-AS1-MUT)购自苏州吉玛基因股份有限公司。胎牛血清、RPMI1640培养基、DMEM培养基购自美国Hyclone公司。Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司。qPCR试剂盒和MTT试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司。一抗(CDC73、cyclin D3、CDK2、α-tubulin、claudin-1、E-Cadherin)和辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。

3.细胞培养和转染：将SV-HUC-1细胞加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，将RT-4、BIU-87、T24、5637细胞加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5% CO2培养箱培养。将对数生长期的5637细胞分为对照组和KIZ-AS1组，根据感染复数为30，分别感染阴性对照慢病毒和KIZ-AS1慢病毒，于感染48h后收集各组细胞进行后续实验。

4.qPCR检测：TRIzol法提取膀胱癌组织和细胞系总RNA，反转录获得cDNA。按照qPCR试剂盒说明书设定反应体系和反应参数，KIZ-AS1和CDC73 mRNA以GAPDH为内参，miR-1290以U6为内参。KIZ-AS1、miR-1290和CDC73 mRNA相对表达水平按照2-ΔΔCt方法计算。qPCR引物序列如下，KIZ-AS1正向引物：5′-TTTCCAGCATTTCCCATAGC-3′，反向引物：5′-CAGGTGGAATGTGGAACGA-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，反向引物：5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′；miR-1290正向引物：5′-TGGATTTTTGGATCAGGG-3′，反向引物：5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH正向引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，反向引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；CDC73正向引物：5′-GAGAGAGTATGGAGGACA-CGAAC-3′，反向引物：5′-ATTTGGGGCAGGTCGCTGTTCA-3′。

5.生物信息学技术预测和双荧光素酶报告基因实验验证：采用starBase v2.0数据库预测KIZ-AS1互补结合的miRNA。将KIZ-AS1-WT、KIZ-AS1-MUT分别与miR-1290 mimic、miR-NC mimic采用Lipofectamine 3000转染试剂共转染至5637细胞。转染48h，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，分别检测海参荧光素酶发光强度和萤火虫荧光素酶发光强度，两者的比值代表KIZ-AS1与miR-1290的结合力。

6.Western blot法检测：5637细胞感染48h后，加入细胞裂解液提取总蛋白，调节每组蛋白的上样量，采用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，进一步转至硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中封闭，稀释一抗：CDC73(1∶2000稀释)、cyclin D3(1∶3000稀释)、CDK2(1∶2000稀释)、E-cadherin(1∶1000)、claudin-1(1∶1000)及α-tubulin(1∶3000)，在4℃冰箱内孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h。均匀滴加化学发光试剂，采用凝胶成像系统中曝光、拍照。

7.MTT法检测：5637细胞感染48h后，按照1×103个/孔加入96孔板中，分别培养1、2、3、4、5天后加入浓度为5%的MTT溶液20μl，正常培养4h，吸出上清液，加入140μl二甲基亚砜，在振荡器振荡10min。采用酶标仪检测波长450nm处的吸光度(A)值，实验重复4次。

8.Transwell实验检测：5637细胞感染48h后，采用无血清培养基重悬5637细胞至2×105个/毫升，取180μl细胞悬液加入Transwell上室，加入600μl含体积分数10%胎牛血清的培养基至下室。培养箱培养24h，采用体积分数1%多聚甲醛固定10min，采用质量分数0.2%结晶紫染液染色10min，流水冲洗并风干，采用显微镜(×100)下拍照、计数进入膜下的细胞数，实验重复4次。

结 果

1.膀胱癌组织和癌旁组织中KIZ-AS1表达水平：如图1所示，膀胱癌组织和癌旁组织中KIZ-AS1表达分别为1.46±0.41和6.69±1.15，癌旁组织的KIZ-AS1表达是膀胱癌组织的4.58倍，显著高于膀胱癌组织(P<0.01)。

图1 膀胱癌组织和癌旁组织中KIZ-AS1表达水平

2.膀胱癌细胞和膀胱上皮永生化细胞细胞中KIZ-AS1表达水平：膀胱癌RT-4、BIU-87、T24、5637细胞中KIZ-AS1的表达分别为0.53±0.07、0.63±0.03、0.35±0.04、0.17±0.03，明显低于膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1(1.04±0.14)，差异有统计学意义(P均<0.05，图2)，5637细胞中KIZ-AS1表达水平最低(P<0.01)，选择5637细胞进行后续研究。

图2 膀胱上皮永生化细胞和膀胱癌细胞中KIZ-AS1表达水平与SV-HUC-1细胞比较，*P<0.05，**P<0.01

3.对照组和KIZ-AS1组5637细胞中KIZ-AS1的表达水平：qPCR结果显示，KIZ-AS1组和对照组5637细胞中KIZ-AS1表达分别为11.29±1.87和1.06±0.25，差异有统计学意义(P<0.01)。

4.过表达KIZ-AS1抑制5637细胞增殖活力：MTT法结果显示，从第2天起，KIZ-AS1组5637细胞增殖活力显著低于对照组(P<0.05，图3)。

图3 MTT检测KIZ-AS1对5637细胞增殖活力的影响与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

5.过表达KIZ-AS1抑制5637细胞迁移能力：Transwell实验显示，对照组和KIZ-AS1组5637细胞迁移数分别为71.53±6.23个和26.87±3.88个，与对照组比较，过表达KIZ-AS1可明显抑制5637细胞迁移(P<0.01，图4)。

图4 Transwell实验检测KIZ-AS1对5637细胞迁移能力的影响A.Transwell实验检测KIZ-AS1对膀胱癌细胞迁移的影响(结晶紫染色，×100)；B.细胞迁移数的半定量分析

6.生物信息学技术预测及双荧光素酶报告基因实验验证KIZ-AS1的潜在机制：利用starBase v2.0数据库预测miR-1290可能是KIZ-AS1的靶基因，预测序列见图5。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与miR-NC组比较，miR-1290组KIZ-AS1-WT细胞中相对荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，KIZ-AS1-MUT细胞中相对荧光素酶活性无明显变化(P>0.05，图6)。

图5 生物信息学技术预测KIZ-AS1的潜在机制

图6 双荧光素酶报告基因实验验证KIZ-AS1的潜在机制

7.过表达KIZ-AS1的5637细胞中miR-1290和CDC73 mRNA表达变化：qPCR检测显示，对照组和KIZ-AS1组5637细胞miR-1290的表达分别为1.11±0.15和0.40±0.09，过表达KIZ-AS1显著下调miR-1290的表达(P<0.01)。对照组和KIZ-AS1组5637细胞CDC73 mRNA的表达分别为1.02±0.17和4.94±0.90，过表达KIZ-AS1显著上调CDC73 mRNA的表达(P<0.01)。

8.过表达KIZ-AS1促进CDC73蛋白表达：Western blot法检测结果显示，过表达KIZ-AS1后5637细胞中CDC73蛋白表达明显增加，细胞增殖蛋白如cyclin D3、CDK2表达降低，细胞迁移蛋白如claudin-1、E-cadherin表达明显增加，提示5637细胞的增殖和迁移能力明显降低(图7)。

图7 Western blot法检测CDC73蛋白及细胞功能蛋白表达情况

讨 论

lncRNA是一大类长度>200个核苷酸的内源性单链RNA，已被证明在各种恶性肿瘤组织或外周血清中异常上调或下调，表现为促癌因子或抑癌因子作用[10～12]。伴随测序技术的不断发展，越来越多的lncRNA被发现在膀胱癌细胞中发挥重要功能[13, 14]。Zhang等[15]研究表明，在膀胱癌组织中发现lncRNA BCAR4表达升高，沉默lncRNA BCAR4可通过调节miR-370-3p表达，抑制膀胱癌5637和T24细胞的增殖并诱导细胞凋亡。He等[16]研究表明，lncRNA ZNF503-AS1在膀胱癌组织中降低，过表达ZNF503-AS1可通过与转录因子GATA6结合，减弱膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，促进膀胱癌细胞凋亡。本研究结果发现，与癌旁组织比较，膀胱癌组织中KIZ-AS1相对表达水平显著降低；与膀胱上皮永生化细胞比较，膀胱癌细胞系中KIZ-AS1相对表达水平明显降低；过表达KIZ-AS1可抑制膀胱癌5637细胞的增殖和迁移，提示KIZ-AS1低表达可能与膀胱癌的发生、发展有关，KIZ-AS1在膀胱癌细胞中可能发挥抑癌因子作用。

lncRNA主要通过竞争性结合miRNA应答元件，降低miRNA表达水平，阻止miRNA与靶基因mRNA的结合，促进靶基因mRNA的表达[17, 18]。本研究利用starBase v2.0预测显示，KIZ-AS1与miR-1290可能存在结合位点，双荧光素酶报告基因实验进一步证实了KIZ-AS1和miR-1290的靶向关系。近年来研究证实，miR-1290高表达与胰腺癌、结直肠癌的发生和发展有关，外周血miR-1290高表达是肿瘤患者预后不良的重要标志物[19, 20]。Wang等[9]研究表明，miR-1290在膀胱癌组织和细胞系中表达明显上调，CDC73基因在膀胱癌组织和细胞系中低表达，miR-1290通过靶向抑制CDC73基因表达，促进膀胱癌细胞的增殖和转移。qPCR和Western blot法检测结果显示，过表达KIZ-AS1后，miR-1290表达明显降低，CDC73基因表达明显增加，表明KIZ-AS1通过竞争性结合miR-1290应答元件，促进CDC73基因表达，抑制膀胱癌的发生和发展。Western blot法检测结果显示，过表达KIZ-AS1后，细胞增殖蛋白如cyclin D3、CDK2表达减少，细胞迁移蛋白如claudin-1、E-cadherin表达明显增加，表明5637细胞增殖和迁移能力明显降低。

综上所述，膀胱癌组织和细胞系中KIZ-AS1表达下调，KIZ-AS1通过抑制miR-1290表达，间接增高CDC73基因表达，进而抑制膀胱癌5637细胞的增殖和迁移。KIZ-AS1/miR-1290/CDC73轴的研究为膀胱癌诊断和靶向治疗提供了一定的实验依据。