姜酮在博来霉素诱导小鼠肺纤维化中的保护作用及机制研究

胡晓晴 熊 娟 范国华 周 倩

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种进行性且可致死的慢性肺部疾病。IPF患者长期预后差，在全球范围内的发生率逐年升高[1]。IPF以肺泡上皮细胞损伤、不受控制的肌成纤维细胞增殖和异常的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积为病理特征，最终可导致肺泡壁的破坏和呼吸衰竭[2]。目前，IPF发生的分子机制尚未完全明确，研究表明肺组织中氧化和抗氧化失衡可加重在IPF进展。转录因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是机体重要对的转录因子，可转录激活多种抗氧化基因，同时还可抑制多种纤维化疾病的进展[3，4]。因此，探寻可激活NRF2的药物对今后IPF的预防和治疗具有重要意义。

姜酮(zingerone，ZO)是一种无毒且价格低廉的天然化合物，主要从调味植物生姜中提取，已被证实具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌和抗糖尿病活性[5～7]。既往研究表明，ZO可以通过激活NRF2减轻压力负荷过载诱导的小鼠心肌纤维化[8]。但ZO是否可以改善BLM诱导小鼠肺纤维化目前尚未有研究报道。本研究拟通过气管注射博来霉素(bleomycin，BLM)的方式以建立小鼠IPF模型, 同时观察不同剂量的ZO干预对IPF小鼠肺纤维化的影响并探讨潜在机制。

材料与方法

1.材料: 博来霉素(bleomycin，BLM，纯度: 99.2%，批号：M1180)购自迈瑞达科技(北京)有限公司；姜酮(纯度: ≥98%，批号：CAS122-48-5)购自上海融禾医药科技发展有限公司；一抗：GAPDH(批号：ab8245)、collagenⅠ(批号：ab34710)、α-SMA(批号：ab7817)、NRF2(批号：ab62352)、羊抗兔 IgG (批号: ab124055)购自英国Abcam公司；苏木精-伊红(HE)染色液试剂盒购自深圳市达科为生物工程有限公司；马松染色试剂盒购自武汉卡诺斯科技有限公司。

2.实验动物及IPF小鼠模型的建立: 本实验中所使用的实验动物为雄性C57BL/6小鼠(8～10周)，体质量为235～300g，购自湖北省预防医学科学院动物中心。根据随机数字表法将 40 只小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量ZO治疗组及高剂量ZO治疗组，每组10只。模型组、低剂量ZO治疗组及高剂量ZO治疗组小鼠接受气管单次注射BLM(5mg/kg)以构建肺纤维化模型。低剂量ZO治疗组及高剂量ZO治疗组小鼠于BLM注射24h后分别给予10mg/kg和20mg/kg ZO灌胃，每4天1次。28天后，通过颈椎脱臼法处死小鼠后，留取双侧肺组织。

3.HE染色: 取小鼠右肺组织，用10%甲醛溶液固定并脱水，随后用石蜡包埋并切片。将肺石蜡切片于二甲苯和梯度乙醇中脱蜡并水化，苏木精染细胞核，伊红染细胞质，脱水封片后在光学显微镜下观察各组肺组织的病理形态。

4.Masson染色: 将Weigert铁苏木精A液和Weigert铁苏木精B液等量混合获得Weigert铁苏木精染色液，使用Weigert 铁苏木精染色液染色。酸性乙醇分化后，使用蓝化液蓝化。随后使用丽春红品红染色液染色并使用苯胺蓝染色液复染，脱水后在光学显微镜下观测肺纤维化水平，并根据Ashcroft评分表对各组小鼠肺纤维化进行评分。

5.ELISA试剂盒检测MDA，SOD及羟脯氨酸: 取冻存肺组织40～50mg，将肺组织研磨成匀浆后，根据试剂盒说明书上的步骤分别检测各组小鼠肺组织中MDA、SOD和羟脯氨酸的含量。

6.Western blot法检测: 提取各组小鼠右肺肌组织总蛋白，随后对其进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将凝胶中的蛋白进行转膜，随后分别用抗collagen Ⅰ、α-SMA、NRF2及GAPDH的一抗在4℃下孵育过夜。次日，于二抗(羊抗兔)稀释液中避光孵育50min。孵育结束后，使用Odyssey扫膜仪对各蛋白条带扫描并定量，以GAPDH作为内参蛋白对各样本目的蛋白进行校正。

结 果

1.各组小鼠肺组织HE染色及Masson染色结果： 在BLM注射后的28天，取肺组织进行Masson染色及HE染色。结果表明，BLM刺激可明显促进小鼠肺组织胶原沉积和病理损伤，增加小鼠Ashcroft评分(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干预均可明显减轻小鼠肺组织胶原沉积及病理损伤，降低Ashcroft评分(P<0.05)，详见图1。

图1 各组小鼠肺组织HE染色及Masson染色结果(×200)与对照组比较, *P<0.05；与模型组比较, #P<0.05

2.各组小鼠肺组织氧化应激和羟脯氨酸水平的比较：接下来，BLM注射28天后，BLM刺激可明显增加小鼠肺组织MDA水平(P<0.05)，同时抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干预后，肺纤维化小鼠肺组织中MDA水平明显降低(P<0.05)，SOD活性明显增加(P<0.05)。模型组小鼠肺组织中羟脯氨酸水平较对照组明显增加(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干预后，肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸水平均明显降低(P<0.05)，详见图2。

图2 各组小鼠肺组织氧化应激和羟脯氨酸水平的比较与对照组比较, *P<0.05；与模型组比较, #P<0.05

3.各组小鼠肺组织纤维化标志蛋白的表达状况：Western blot法检测结果表明，模型组小鼠肺组织中collagenⅠ和α-SMA表达水平较对照组明显增加(P<0.05)；10mg/kg和20mg/kgZO干预后，肺纤维化小鼠肺组织中上述两种蛋白水平均明显降低(P<0.05)，详见图3。

图3 各组小鼠肺组织纤维化标志蛋白的表达状况与对照组比较, *P<0.05；与模型组比较, #P<0.05

4.各组小鼠肺组织NRF2的蛋白表达状况：Western blot法检测结果表明，模型组小鼠肺组织中NRF2表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kgZO干预后，肺纤维化小鼠肺组织中NRF2表达水均明显升高(P<0.05)，详见图4。

图4 各组小鼠肺组织NRF2的蛋白表达状况与对照组比较, *P<0.05；与模型组比较, #P<0.05

讨 论

肺纤维化是各种慢性肺部疾病共有的病理改变[9]。机体为修复肺间质的慢性损伤，间质细胞会持续分泌胶原蛋白，最终导致肺内细胞外基质沉积及肺组织结构破坏[10]。正常肺组织由肺上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及巨噬细胞组成。这些细胞在病理因素，如BLM、高糖或长期空气污染的刺激下可通过不同机制导致肺纤维化的发生[11]。例如，成肺纤维细胞可通过增殖分化为肌成纤维细胞，产生大量胶原沉积于细胞外基质； 2型上皮细胞不仅可以通过细胞凋亡的方式导致肺上皮再生受损及肺骨架缺失，还可通过上皮-间质转化的方式增加间质细胞的数量，最终导致肺纤维化进展[12]。此外，内皮细胞则可通过内皮-间质转化的方式加重肺纤维化[13]。巨噬细胞在病理刺激下，可由M1转化为M2型，产生促纤维化因子包括转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)，导致肺纤维化[14]。因此，以上述细胞为靶点进行干预，是肺纤维化防治的重要策略。

在肺纤维化的进展过程中，氧化应激被明显激活。例如，大量ROS可导致肺上皮细胞DNA损伤和凋亡，通过诱发TGF-β的激活和释放；此外ROS还可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化[15，16]。研究显示，NRF2在多种疾病模型中可显著抑制细胞内ROS生成，同时，NRF2还可转录激活多种抗氧化基因，发挥细胞保护作用。NRF2基因敲除小鼠相较于野生型小鼠在BLM刺激下更易产生肺纤维化表型[17]。体外实验也表明，NRF2 抑制不仅增加了成纤维细胞氧化应激水平，还诱导了其向肌成纤维细胞的表型转化[18，19]。这些实验结果表明，NRF2是干预肺纤维化的重要靶点。

ZO作为一种生姜中提取的天然化合物，具有重要的抗纤维化作用，包括心肌纤维化和肝脏纤维化。在心肌纤维化中，ZO可通过激活eNOS/NRF2轴抑制氧化应激进而减轻心肌组织中胶原纤维合成，发挥心脏保护作用[8]。在非酒精性脂肪肝中，ZO可通过改善小鼠血糖、血脂、肝功能进而减轻肝脏纤维化[20]。本研究中笔者发现，两种剂量的ZO干预不仅可明显减轻小鼠肺组织病理损伤和肺间质胶原沉积，还可抑制小鼠肺组织纤维化。机制上，ZO可明显上调IPF小鼠肺组织中NRF2的表达。

综上所述，ZO可能通过激活NRF2改善BLM诱导小鼠肺纤维化和氧化应激，发挥肺保护作用。