两种脐带间充质干细胞标记方法及在1型糖尿病小鼠体内示踪的研究

刘 鹏 王从容

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一种严重的自身免疫疾病，主要以T淋巴细胞介导的β细胞破坏为主要特征，可导致胰岛素分泌绝对不足，引发高血糖[1]。T1DM需终身使用外源性胰岛素，如治疗不及时或治疗不当会引起严重并发症，影响患者生活质量，甚至危及生命。目前临床上使用的胰岛素可有效降低血糖，从一定程度上减缓糖尿病患者并发症的发生及进展速度，但却无法从源头上遏制胰岛β细胞的损伤。因此，针对T1DM开发一种新的治疗方式尤为重要。近年来，干细胞治疗各个领域疾病的基础和临床研究备受关注。人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)由于其再生能力强、高可塑性及低免疫原性等特点被广泛应用于基础和临床探索性研究[2]。

动物和临床探索性研究均表明，hUC-MSCs单独或联合其他细胞有望改善T1DM[3～6]。然而，细胞在移植受体中的分布、迁移和分化尚不完全明确。采用示踪方法明确移植的细胞是否能归巢到受损器官是hUC-MSCs治疗T1DM发挥作用的关键因素之一。即往研究中，干细胞示踪的标记方法有很多，主要包括使用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作为报告基因转入细胞，用假核酸分子Brdu标记，生物染料PKH26、CFSE、DiL、DiR等标记，以及直接检测受体组织中的人源基因序列的方法[4, 7～11]。其中，报告基因转染步骤较为复杂，且荧光强度随着细胞传代呈递减状态，因此，GFP标记法存在不够稳定、可实施性较差的问题[12]。另一种Brdu也是较为常用的细胞标记方法。但由于已凋亡的移植细胞释放出的Brdu可渗入周围任何处于细胞分裂S期的细胞，因此Brdu无法判断标记细胞是正在分裂的移植细胞还是宿主细胞[13]。

目前，在基础研究中较为常用的标记细胞方法为直接标记移植细胞的细胞膜，但该方法在T1DM动物模型中的应用效果尚不明确[14]。本研究首次采用两种方法，分别用亲脂性细胞膜荧光染料PKH26与DiR对hUC-MSCs直接进行标记，通过构建T1DM小鼠模型，比较尾静脉注射PKH26标记的hUC-MSCs后组织学染色或DiR标记的hUC-MSCs后动物活体成像两种示踪方法的优缺点，为探索hUC-MSCs静脉注射后对T1DM小鼠的归巢特征提供基础。

材料与方法

1.材料：6～8周龄C57BL/6J小鼠，体质量为18～21g，由上海市第六人民医院动物房提供，饲养于上海市第六人民医院动物房SPF环境，用于T1DM小鼠模型构建。hUC-MSCs由上海市东方医院干细胞基地GMP实验室提供，原代细胞提取、传代、鉴定方法及结果见参考文献[15]。链尿佐菌素(streptozotocin, STZ)购自美国Sigma-Aldrich公司，MEM Alpha培养基、胎牛血清FBS购自美国Gibco公司，细胞膜染料PKH26购自美国Sigma-Aldrich公司，细胞膜染料DiR购自美国Thermo Fisher公司。

2.动物分组及T1DM模型构建：T1DM小鼠模型的构建方法为C57BL/6J小鼠单次腹腔注射STZ溶液(50mg/kg)，1周后测定随机血糖>16.7mmol/L认为T1DM小鼠模型造模成功，未注射STZ的C57BL/6J小鼠作为正常对照。构建成功的T1DM模型小鼠分为4组，分别是PKH26标记细胞注射组(PKH26+组)及空白对照组(对照组1)，DiR标记细胞注射组(DiR+组)及空白对照组(对照组2)，每组小鼠数量为3只。

3.PKH26标记hUC-MSCs：取第4代hUC-MSCs，将用胰蛋白酶消化后的细胞置于离心管中，1500r/min离心5min后弃上清，再用PBS清洗1次，重悬于稀释液C内(细胞浓度约为2×107/ml)。避光环境下，将以上细胞悬液迅速加入PKH26稀释液中，反复吹打混匀，于室温避光孵育3min，每隔1min颠倒混匀1次。随后加入1ml血清终止染色。1500r/min离心5min后弃上清，用含血清培养基洗涤细胞3次，最后用PBS重悬细胞，用于尾静脉注射。

4.DiR标记hUC-MSCs：取第4代hUC-MSCs，将用胰蛋白酶消化后的细胞置于离心管中，1500r/min离心5min后弃上清，重悬于PBS内[细胞浓度约为(3～5)×106/ml]。避光环境下，向每毫升细胞悬液中加入1μl浓度为10mmol/L的DiR稀释液，反复吹打混匀，置于细胞培养箱中染色30min。加入PBS冲洗细胞悬液，1500r/min离心5min，再用PBS洗涤细胞2次，最后用PBS重悬细胞，用于尾静脉注射。

5.细胞移植：将PKH26或DiR标记的hUC-MSCs经尾静脉移植入T1DM小鼠，每只小鼠注射的细胞量为1×106，对照组1及对照组2均注射等体积的PBS，每组各3只，于移植后24h取材或进行活体成像。

6.观察PKH26标记的hUC-MSCs在T1DM小鼠组织中的归巢：hUC-MSCs移植24h后麻醉小鼠，通过左心室用0.9%氯化钠溶液进行灌注，取胰腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等6种组织用OCT进行包埋。用冷冻切片机进行常规切片，切片厚度约6～10μm。随后用细胞核染料DAPI染细胞核，室温孵育7min，用PBS洗涤3次，每次5min。最后用50%甘油PBS封片后在荧光显微镜下观察。

7.活体观察DiR标记的hUC-MSCs在T1DM小鼠脏器内的归巢：hUC-MSCs移植24h后麻醉小鼠，采用活体成像系统检测荧光信号强度，同时用PBS注射作为对照组2去除生物发光背景。活体成像结束后，将小鼠过量麻醉致死，取胰腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等6种脏器分别在活体成像系统中成像，观察hUC-MSCs在不同器官中归巢情况。

结 果

1.体外PKH26标记hUC-MSCs的效果观察：荧光倒置显微镜下观察，hUC-MSCs细胞悬液经PKH26标记后，可见整个细胞均呈现红色，染色效率约为100%(图1)。

图1 PKH26染色效率A.hUC-MSCs光学显微镜照片；B.同一视野下PKH26染色后荧光效果(×200)

2.体外DiR标记hUC-MSCs的效果观察：细胞悬液经DiR染色，经活体成像系统成像后发光强度为2.5×1010p/s，显著高于未染色hUC-MSCs细胞(图2)。

图2 活体成像系统下DiR体外荧光强度检测A.未染色hUC-MSCs成像；B.DiR染色hUC-MSCs成像

3.T1DM小鼠模型鉴定：STZ注射后6天，T1DM小鼠模型随机血糖升至16.31±2.44mmol/L(图3)，12天后上升至25mmol/L左右，而正常对照小鼠随机血糖维持在8mmol/L左右，T1DM小鼠造模成功。

图3 T1DM小鼠模型鉴定与正常对照比较，*P<0.01

4.PKH26标记的hUC-MSCs在T1DM小鼠体内示踪效果：PKH26标记的hUC-MSCs尾静脉移植入T1DM小鼠体内后24h，取PKH26+组T1DM小鼠胰腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等6种组织制作冷冻切片在荧光倒置显微镜下观察，发现在以上器官中均可找到红色荧光标记的细胞，荧光强度较为明显，但细胞形态不规则(图4A)。其中，荧光信号表达量最高的器官为脾脏组织，其次为肝脏和肺组织，在胰腺组织中也可观察到发射红色荧光的hUC-MSCs，归巢效果最不明显的为心肌组织(图4B)。

图4 PKH26标记hUC-MSCs在T1DM小鼠体内示踪A.荧光显微镜下各组织中hUC-MSCs归巢情况(×200);B.荧光量化结果。箭头所示为组织冷冻切片中PKH26染色阳性的细胞

5.DiR标记的hUC-MSCs在T1DM小鼠体内示踪效果：动物活体成像结果显示，DiR+组在hUC-MSCs移植24h后即可在体内检测到hUC-MSCs发射的荧光信号，经量化后与对照组2比较，差异有统计学意义 [(2.21±0.07)×109p/s vs (7.80±0.60)×109p/s，P=0.000]， 且主要集中在胸腹腔脏器分布部位，判断结果为阳性。分析小鼠各脏器荧光表达量，结果表明，在所进行荧光检测的6种脏器中，肝脏平均荧光表达量最高，为(378.13±10.00)×108p/s。肺次之，平均荧光表达量为(81.98±2.44)×108p/s。心脏中检测到的平均荧光表达量最低，为7.8×107p/s。在T1DM小鼠胰腺中也检测到阳性荧光信号，平均表达量为(1.14±0.11)×108p/s。各组织平均荧光表达量详见图5。

图5 DiR标记hUC-MSCs在T1DM小鼠体内示踪A.T1DM小鼠活体动物成像；B.活体成像量化结果；C.T1DM小鼠脏器成像；D.脏器成像量化结果

讨 论

运用模型动物可模拟人体糖尿病状态下的疾病特征，为研究hUC-MSCs在T1DM患者体内的归巢提供参考。hUC-MSCs作为间充质干细胞的重要来源之一，在糖尿病治疗领域已取得一定进展。其发挥作用的机制包括调节免疫、分泌各种细胞因子等[2]。干细胞在动物体内的归巢程度对于明确hUC-MSCs治疗T1DM的机制研究具有重要意义。Maldonado等[4]用DiL标记hUC-MSCs后腹腔注射入T1DM小鼠体内，解剖后可在小鼠腹腔观察到呈红染的胰腺。同时，实时荧光定量PCR检测小鼠各部分脏器中人源DNA序列的表达量，可在小鼠肝脏、肾脏、胰腺、脾脏组织中检测到人源DNA的表达，提示在T1DM小鼠的胰腺中存在归巢的hUC-MSCs。然而，DiL标记实验中肉眼观察到的呈红染的胰腺组织不能排除是由于移植细胞所携带的荧光染料转移至胰腺所造成的假阳性结果。另一方面，人源DNA的定量检测结果虽相对可靠，但缺乏直观的影像观察结果。DiR作为一种发近红外荧光亲脂性细胞膜染料(与DiO、DiD、DiL属于同一家族)，在嵌入细胞膜后会发出明亮且稳定的荧光，这类染料有很高的激发态寿命和淬灭常数，染色效率极高，且对细胞生物特性及生理状态无明显影响。相较于其他细胞标记方式，DiR的发射波长约为780nm，组织穿透力更强，其发射光基本不受机体自身组织背景的干扰，是用于动物活体成像的理想材料[14, 16, 17]。另一方面，PKH26的发射波长为576nm，与DiR比较，更适合于荧光显微镜下观察。

由于临床上进行干细胞移植多采用静脉注射[18, 19]。因此，本研究选用尾静脉注射方式作为hUC-MSCs动物示踪的研究方法。本研究首次应用PKH26与DiR两种标记细胞方式，对hUC-MSCs在T1DM小鼠模型中进行示踪，获得较好的成像效果。一方面，移植后24h，可在荧光显微镜下观察到胰腺组织冷冻切片中PKH26标记的细胞，证实了尾静脉注射的hUC-MSCs可归巢至STZ诱导的T1DM小鼠胰腺，同时也证实了hUC-MSCs在高血糖微环境中的趋化能力，与Yin等[20]报道的结果一致。在肝脏、脾脏、肺、肾脏、心脏等组织中均可观察到PKH26阳性细胞。量化结果显示，脾脏组织切片中PKH26阳性表达的细胞最多，其次为肝脏、肺等血管丰富的器官。胰腺组织中观察到的hUC-MSCs高与心脏和肾脏组织。另一方面，采用DiR标记的细胞对T1DM小鼠进行活体成像，结果显示在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胰腺中均可检测到阳性荧光信号。胰腺组织中也可观察到阳性荧光信号，且荧光信号高与心脏和肾脏组织。与PKH26标记细胞示踪结果不同的是，DiR标记的成像结果中可在肝脏中观察到较强的荧光信号，这可能与肝脏血供较为充沛且脏器体积较大有关。

当然，PKH26与DiR标记方法也存在一定的不足，有报道称细胞膜亲脂染料可能存在染料转移现象，即移植入体内的细胞凋亡破碎后，其细胞碎片可能会被临近巨噬细胞吞噬，细胞膜上的染料随之转移至这些细胞膜上。同时，细胞膜染料的局限性还在于不能区分观察到的阳性信号是存活细胞还是凋亡细胞，在体内示踪检测移植细胞的存活状态方面没有报告基因标记有优势。因此，有待于开发一种能在活体中稳定表达，且能特异性标记移植的存活细胞的示踪方法。

本研究表明，采用PKH26或DiR标记hUC-MSCs可观察到T1DM小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胰腺中移植细胞的归巢情况，并对实验结果进行量化。其中，PKH26标记适用于荧光显微镜下观察对组织切片中的hUC-MSCs移植细胞进行量化。DiR标记适用于在活体成像系统中观察hUC-MSCs移植细胞在活体动物组织中的分布，并进行离体组织量化。本研究为hUC-MSCs治疗T1DM的机制研究奠定基础。