不同苹果果实发育过程中酚类物质含量及抗氧化能力变化研究

郭子微，侯文赫，付鸿博，张建英，王鹏飞，穆霄鹏，张建成

（1.山西农业大学园艺学院，山西 晋中 030801；2.山西农业大学果树研究所，山西 晋中 030801）

苹果在我国果树种植中有重要的地位，占所有果树产量的30%，作为我国出口农产品之一，具有较强的竞争力［1］。山定子在生产中多被用作砧木，具有多种抗性，寒旱地区常选用［2］。红满堂是一种观赏类苹果品种，由山西省农业科学院果树研究所利用舞美、山定子为亲本杂交选育出的，其果皮、果肉均为红色［3］。富士是我国现阶段主栽品种之一，以其晚熟、品质好、耐贮藏等优点，广受生产者、消费者欢迎［4］。

植物有产生大量代谢物的能力，其中大多为次级代谢物，为植物提供了在不断变化的环境中生存所需的适应性机制［5］。酚类化合物是一类芳香族化合物，是植物界中最普遍的次级代谢物，在植物生长发育过程中发挥着广泛的生理生态作用。由于其羟基取代的高反应性和其吞噬自由基的能力，这些化合物具有抗氧化活性的潜力。而类黄酮化合物是水果和蔬菜中最常见的酚类化合物，包括黄酮、黄酮醇和黄烷酮。类黄酮化合物具有多种生物作用，由于其螯合特性，已被证实具有抗炎、抗病毒和抗癌特性［6］。

水果和蔬菜的天然抗氧化作用与三大类物质——维生素、类胡萝卜素以及酚类物质有关［7］，其中，起主要作用的是酚类物质，维生素C和类胡萝卜素在抗氧化过程中起的作用远不如酚类化合物［8］。如在苹果中，多酚等物质被证明是抗氧化的主要来源，而维生素C仅贡献不到0.4%［9，10］。酚类化合物具有极强的抗氧化活性，有助于改善植物的颜色、风味并保护其免受一定程度的生物胁迫和非生物胁迫；对癌症和心脑血管疾病等具有治疗作用［11］，可通过各种机制影响与癌症相关的基本细胞的功能，可能通过诱导细胞周期停滞和凋亡来抑制肿瘤的形成和生长［12］。苹果是人类摄取酚类化合物的重要来源之一，王思新等［13］对我国9个常见苹果栽培种秦冠、嘎拉、富士、华帅等的多酚物质含量及其在发育过程中的变化动态进行了研究；另外，研究人员也已对红枣［14］、梨［15］、石榴［16］、李［17］、葡萄［18］中的酚类物质含量及抗氧化活性进行了研究。

本试验用紫外分光光度法对砧木品种山定子、非红肉苹果富士以及山西特有的红肉苹果红满堂不同发育时期的果实酚类物质含量及抗氧化活性的动态变化进行分析研究，以期为科学评价和鉴定不同基因型苹果果实的酚类物质、丰富其代谢规律奠定基础，从而为高类黄酮苹果品种的选育和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用常用砧木品种‘山定子’、红肉品种‘红满堂’及常见非红肉栽培种‘富士’，均种植于山西省农业科学院果树研究所苹果资源圃。于2020年6月3日幼果期开始采集果实材料，每15天取样一次，至2020年10月26日成熟期采集完成，共采集10次。每次采样均从长势良好的同株树上随机采集无病虫害且大小均匀的果实，每个品种分为3个重复，洗净后去核切块，置-80℃冰箱保存备用。

1.2 仪器与试剂

型号JJ224BC电子天平；型号SB25-12DTD超声清洗器；型号UV-5200紫外可见分光光度计；型号HC-2518R高速冷冻离心机。

ABTS、DPPH、TPTZ、矢车菊素-3-O-葡萄糖、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、芦丁、水溶性VE、（+）-儿茶素、Folin-酚试剂、盐酸、浓盐酸、硝酸铝、香草醛、氢氧化钠、甲醇、无水乙醇、无水碳酸钠等。

1.3 单果重及纵横径的测量

用电子天平（精度0.0001 g）和游标卡尺进行单果重和纵横径的测量。

1.4 分光光度法测定酚类物质含量

1.4.1 总酚（TPC）和类黄酮（TFC）含量的测定 待测液制备：称取0.600 g果实样品，加液氮研磨，按照1∶10的料液比加入酸化甲醇（体积分数40%甲醇、体积分数0.1%盐酸），超声波提取后离心15 min，重复两次，合并上清液，待测。

总酚含量测定：采用Folin-Ciocalteu试剂法［19］，并作修改。将0.2 mL福林酚试剂与相同体积待测液混匀静置后加入10%的Na2CO31 mL，用6.6 mL蒸馏水定容，然后35℃水浴1 h后在760 nm下比色。用没食子酸做标准曲线：称取没食子酸标准品0.001 g，蒸馏水溶解后定容至10 mL棕色容量瓶内，即获得浓度为0.1 mg/mL的没食子酸对照品母液；分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL没食子酸母液于10 mL离心管中，配制不同浓度梯度的没食子酸溶液，后续步骤同上，以浓度（mg/mL）为横坐标、吸光值为纵坐标进行直线回归。

类黄酮含量测定：采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法［20］。向0.2 mL待测液中依次加入5%的NaNO2溶液0.3 mL、10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL、4%的NaOH溶液4 mL，静置后定容到10 mL，混匀，静置10 min后在510 nm下比色，以上全程均需避光。用芦丁做标准曲线：称取芦丁标准品0.005 g，加入甲醇溶液充分溶解，定容于50 mL棕色容量瓶中，即获得浓度为0.1 mg/mL的芦丁对照品母液，分别吸取0、1、2、3、4、5 mL芦丁母液于10 mL容量瓶中，配制成不同浓度梯度的芦丁溶液，后续步骤同上，以浓度（mg/mL）为横坐标、吸光值为纵坐标进行直线回归。

1.4.2 花青素（AC）含量的测定 称取1.000 g苹果果实样品，加液氮研磨，按照1∶7的料液比加入90%的酸化乙醇（体积分数90%的乙醇+体积分数0.1%的盐酸），40 Hz超声波提取30 min后在4℃、10 000×g下离心30 min，保存上清；向沉积物中加入7 mL酸化乙醇，重复提取；合并两次提取的上清液，备用。

采用pH示差法测定花青素含量［21］：向0.5mL待测液中分别加入0.025 mol/L氯化钾-盐酸缓冲液（pH 1.0）和0.4 mol/L乙酸钠-盐酸缓冲液（pH 4.5），摇匀平衡稳定15 min，分别在520 nm和700 nm处比色，采用公式计算：A=（A520，pH1.0-A700，pH1.0）-（A520，pH4.5-A700，pH4.5）。

1.4.3 原花青素（PAC）和黄烷醇（FAC）含量的测定 称取1.000 g果实样品，加液氮研磨后放入离心管中，加入10%的酸化甲醇4 mL，超声波提取30 min后10 000×g离心10 min，留上清；加入提取液重复提取，将两次提取液合并，备用。

使用盐酸-香草醛法测定原花青素含量［22］：吸取果实提取液1 mL，与50 g/L香草醛甲醇溶液5 mL和10%盐酸甲醇溶液4 mL混匀后避光，35℃水浴20 min，取出于500 nm处比色。结果以儿茶素等价值表示。

采用p-DMACA-盐酸法测定黄烷醇含量［23］，并略作修改：取0.1 mL果实提取液，加入0.1%的p-DMACA-1 mol/L盐酸甲醇溶液3 mL，振荡混匀，室温下静置10 min后于500 nm处比色。用没食子酸做标准曲线。

1.5 抗氧化能力的测定

1.5.1 DPPH·清除法（DPPH法） 采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法进行自由基清除力的分析［24］。吸取0.1 mmol/L DPPH溶液2.8 mL加入到0.2 mL上述1.4.1的待测液中，避光30 min后比色得At30。DPPH自由基清除率（%）=（1-At30/At0）×100，其中，At0为空白对照组的吸光值，即用40%甲醇代替样品反应所得。结果以水溶性维生素E的类似物Trolox的当量表示。

1.5.2 铁离子还原/抗氧化能力法（FRAP法）参考文献［25］，略作修改。取0.1 mol/L醋酸钠缓冲液、20 mmol/L三氯化铁溶液和10 mmol/L三吡啶基三嗪（TPTZ）溶液，按10∶1∶1混合成为反应液；吸取4.9 mL反应液，加入到0.1 mL上述1.4.1的待测液中，混匀后室温避光10 min，然后在593 nm处比色，重复3次。结果以水溶性维生素E的类似物Trolox的当量表示。

1.5.3 ABTS+自由基清除法（ABTS法） 用2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除法进行测定［26］。反应液由7 mmol/L ABTS与140 mmol/L过硫酸钾溶液混合而成，避光后用乙醇稀释至吸光值为0.7左右，备用；吸取3.9 mL反应液加入到0.1 mL上述1.4.1的待测液中，混匀后避光10 min，于734 nm处测吸光值（At10）。ABTS+自由基清除率（%）=（1-At10/At0）×100，其中，At0为空白组吸光值，即用40%甲醇代替样品反应所得。结果以水溶性维生素E类似物Trolox的当量表示。

1.6 数据处理与统计分析

试验过程均进行3次生物学重复，结果采用平均值±标准差表示。用SAS 9.4软件进行统计分析，用Origin 9.0软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同苹果品种果实发育时期单果重及纵横径变化

由表1可见，3个品种苹果果实随着生长发育逐渐膨大。富士果实膨大最为明显，成熟期单果重为幼果的13.28倍；其次为红满堂，成熟期单果重为幼果的3.53倍；而山定子成熟期果实大小与幼果相比变化较小，单果重仅增加1.38倍。从果形来看，红满堂果实为椭圆形，山定子果实由长圆形逐渐发育为椭圆形，富士果实为近圆形。

表1 3个苹果品种生长发育过程中单果重和纵横径的变化

2.2 不同苹果品种果实总酚、类黄酮、花青素、原花青素、黄烷醇含量的动态变化

2.2.1 总酚含量变化 由图1可见，不同品种的总酚含量差异很大。总体来说，山定子的果实总酚含量最高，其次为红满堂，均远高于富士。3个苹果品种果实的总酚含量在整个生长发育期间总体均呈现下降趋势，但不同品种的变化有所不同。红满堂的总酚含量呈先升高后下降再略升的变化趋势，7月4日总酚含量最高（7.395 mg·g-1），9月5日最低（3.405 mg·g-1）；富士的总酚含量在6月3日（4.239 mg·g-1）到8月20日（0.709 mg·g-1）大幅下降，之后略有上升，随后下降，并趋于平稳；山定子的总酚含量呈波动变化，8月20日总酚含量最高（8.151 mg·g-1），10月22日最低（6.054 mg·g-1）。

图1 3种苹果果实生长发育过程中总酚含量的变化

2.2.2 类黄酮含量变化 总体来说，3个苹果品种的类黄酮含量在生长发育过程中呈下降趋势，且山定子的含量明显高于红满堂和富士，红满堂的含量略高于富士（图2）。红满堂和山定子的类黄酮含量均在果实发育初期先上升，于6月18日达到最高值，分别为43.855 mg·g-1和57.838mg·g-1，随后山定子的类黄酮含量持续下降，至10月22日降到最低值（37.165 mg·g-1），红满堂的类黄酮含量则至9月5日降到最低（8.886 mg·g-1）后又有小幅上升。富士的类黄酮含量在6月3日最高30.055 mg·g-1，之后大幅下降，8月3日后又有所回升，至9月24日又开始下降，至10月6日达到最低值5.509 mg·g-1。

图2 3种苹果果实生长发育过程中类黄酮含量的变化

2.2.3 花青素含量变化 红满堂的花青素含量生长前期迅速升高，至8月3日升到最高值0.547mg·g-1，随后快速下降，9月5日后又有所回升，至10月6日达到一个小高峰后又下降，但仍显著高于果实发育初期的含量；富士的花青素含量处于持续上升状态，在10月22日达到最高值（0.207 mg·g-1）；山定子的花青素含量先逐渐降低，7月17日后开始上升，于10月6日达到最高值0.209 mg·g-1，后又略有降低。3个品种间比较，红满堂的花青素含量最高，其次为山定子，红富士的花青素含量最低（图3）。

图3 3种苹果果实生长发育过程中花青素含量的变化

2.2.4 原花青素含量变化 红满堂、富士、山定子的原花青素含量整体均呈下降趋势，均在6月3日时最高，分别为21.446、3.226、43.078 mg·g-1；山定子的原花青素含量最高，富士的最低，红满堂的居于两者之间（图4）。红满堂的原花青素含量前期降幅较大，8月3日后降幅较小，10月22日降到最低值（10.779 mg·g-1）；富士的原花青素含量整体变化幅度较小，10月22日的原花青素含量最低，为1.337mg·g-1；山定子的原花青素前期下降幅度较大，7月4日降到最低值（2.619 mg·g-1），随后略有升高，但仍显著低于6月3日的含量。

图4 3种苹果果实生长发育过程中原花青素含量的变化

2.2.5 黄烷醇含量变化 除富士前期黄烷醇含量呈下降趋势外，3个苹果品种的黄烷醇含量整体呈现先快速上升后缓慢下降再略有升高然后下降的变化趋势；山定子的黄烷醇含量明显高于红满堂和富士，富士除果实发育初期的黄烷醇含量略高于红满堂外，其余时期均明显低于红满堂（图5）。山定子和红满堂的黄烷醇含量均在9月24日达到最高值，分别为19.386 mg·g-1和7.453 mg·g-1，随后逐渐下降，10月底时分别降至12.838 mg·g-1和4.127 mg·g-1；富士果实的黄烷醇含量早期含量无大变化，7月初大幅度下降，随后含量较为稳定，10月底降到最低值0.994 mg·g-1。

图5 3种苹果果实生长发育过程中黄烷醇含量的变化

综合上述分析，苹果果实中生物活性物质的含量明显受到基因型和发育阶段的影响，不同品种在其不同生长阶段的酚类物质含量存在较大差异，这与在猕猴桃［27］、柿果［28］上的研究结果类似。

2.3 抗氧化能力

2.3.1 DPPH·清除能力 所测3个苹果品种均有一定的DPPH·清除能力，除早期红满堂的清除能力较强外，总体表现为山定子＞红满堂＞富士；相较成熟期，3个品种均为幼果期的DPPH自由基清除能力较强，但随果实发育不同品种呈现出不同的变化趋势（图6）。山定子果实的DPPH自由基清除能力在9月之前并无大变化，9月5日后大幅度降低，10月6日降至最低值17.315 mg TE·g-1FW，10月22日又略有回升；红满堂果实的DPPH自由基清除能力在果实发育初期先上升，6月18日达到最高值28.146 mg TE·g-1FW，随后快速下降，9月5日降到最低值9.485 mg TE·g-1FW，随后上升到相对平稳的水平；富士的DPPH自由基清除能力随着果实生长发育逐渐减弱，8月20日达到最低值2.383 mg TE·g-1FW，之后出现小的起伏，以10月22日DPPH自由基清除能力最弱，为2.092 mg TE·g-1FW。

图6 3种苹果果实生长发育过程中DPPH自由基清除能力的变化

2.3.2 铁离子还原/抗氧化能力（FRAP） 3个苹果品种均有一定的铁离子还原/抗氧化能力，山定子最强，红满堂次之，富士最低；从果实发育整个过程来看，铁离子还原/抗氧化能力均呈现下降趋势（图7）。山定子和红满堂在6月到7月间FRAP迅速下降，降幅分别达到44.81%和41.44%，之后变化较小，均在9月24日降到最低值。富士的铁离子还原/抗氧化能力在果实发育过程中变化较平缓，但整体呈降低趋势，成熟期FRAP显著弱于幼果期。

图7 3种苹果果实在生长发育过程中铁离子还原/抗氧化能力的变化

2.3.3 ABTS+自由基清除能力 相较DPPH和FRAP，3个苹果品种均有较强的ABTS+自由基清除能力，山定子的清除能力远强于红满堂和富士；随着苹果果实的发育，3个品种的ABTS+自由基清除能力整体均呈降低趋势（图8）。山定子和红满堂均出现先升高后降低的趋势，6月18日清除能力最高，分别为123.585 mg TE·g-1FW和56.758 mg TE·g-1FW，随后逐渐减弱，最低值分别为66.407 mg TE·g-1FW和22.332 mg TE·g-1FW；富士的ABTS+自由基清除能力则在6月3日至7月4日间降低较快，之后基本稳定。

图8 3种苹果果实生长发育过程中ABTS+自由基清除能力的变化

综上，3种抗氧化能力测定方法中，红满堂和富士的抗氧化活性大小为ABTS＞DPPH＞FRAP，山定子的抗氧化活性大小为ABTS＞FRAP＞DPPH。3个苹果品种中，山定子的抗氧化能力远强于红满堂和富士，富士果实各时期的抗氧化能力较弱，三者均在果实发育早期抗氧化活性较高。

2.4 酚类物质含量与抗氧化能力间的相关性分析

红满堂果实中总酚、类黄酮、原花青素与3种自由基清除能力均显著或极显著相关，黄烷醇与3种自由基清除能力呈正相关但不显著，花青素与3种自由基清除能力呈负相关但不显著（图9A）。其中，类黄酮含量与3种自由基清除能力均极强相关（＞0.80），总酚和类黄酮与DPPH自由基清除能力相关性最强（0.91、0.96），原花青素与FRAP相关性最强（0.93）。

山定子果实中，总酚含量与3种自由基清除能力正相关但不显著；类黄酮含量与FRAP相关但不显著，与DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力显著相关；原花青素含量与FRAP极显著正相关，但却与其他两种自由基清除能力存在微弱的负相关性；黄烷醇含量与ABTS+自由基清除能力呈极显著正相关关系（图9B）。

富士果实中除花青素以外的抗氧化物质含量与各自由基清除能力均有极显著正相关性（图9C）。花青素含量与3种自由基清除能力均呈负相关关系，且与DPPH自由基清除能力和FRAP呈显著或极显著负相关。

图9 3种苹果果实生长发育过程中酚类物质含量与抗氧化指标的相关性

2.5 主成分分析

采用主成分分析法降维（PCA），将原来数量众多且可能具有相关性的一组变量转化为数量较少且无线性相关性的一组综合变量，并能反映原有变量大部分信息［27，29］。本试验对‘红满堂’‘富士’‘山定子’各发育时期进行主成分分析，结果（图10）显示，单果重和黄烷醇位于PC1正向端，总酚、类黄酮、花青素、原花青素位于PC1负向端；除黄烷醇位于PC2负向端以外，其余指标均处于PC2正向端。第一主成分贡献率为93.99%，主要受类黄酮和原花青素影响，且均为正相关；第二主成分贡献率为4.86%，同样受原花青素和类黄酮影响，但类黄酮为负相关，能够较好地反映出原数据的变异情况。山定子各发育时期聚为一类，分布于一、四象限，表明各发育时期黄烷醇的含量较高，且山定子生长发育时果实膨大较不明显，酚类物质含量高可能与此有关；红满堂各发育时期聚为一类，分布于二、三象限。随着果实生长，逐渐由第二象限向第三象限过渡，可能与果实发育早期总酚和类黄酮含量的迅速下降有关，果实发育后期（10月）未与该组聚成一类，可能与花青素含量增高有关；富士发育时期主要聚集在第二象限，在第三象限和第四象限也均有分布，表明果实发育中各指标的变化对果实的影响是复杂的。

图10 3个苹果品种果实发育时期主成分分析

3 讨论

酚类物质作为一种次生代谢产物，贯穿了植物生长发育的全部过程［30］。酚类物质含量高的植物有较高的营养价值和保健功能，苹果是酚类化合物的重要食物来源。本研究结果表明，红满堂、山定子、富士苹果果实中总酚、类黄酮、花青素、原花青素、黄烷醇含量均有较大差异，其中，砧木品种山定子具有较高的总酚、类黄酮、原花青素和黄烷醇含量，红皮红肉品种红满堂具有较高的花青素含量。从整个发育过程看，山定子和红满堂果实中的总酚、类黄酮、花青素和黄烷醇有先上升后下降的趋势，而富士的则均呈下降趋势；3个品种的原花青素含量均呈下降趋势，并趋于变化平缓；不同品种各指标上升和下降的时间点与幅度有所不同。表明在苹果果实发育前期，多酚物质合成较迅速，后期则不同程度地变缓，同时转化加快，总量上表现为下降。而杜国荣［31］在葡萄中的研究表明，在苯丙烷类代谢途径中，成熟后合成总酚和类黄酮的关键酶及调控因子活性增加，这有利于总酚和类黄酮的合成与积累。蒋蕾［32］的研究则表明，莲子发育过程中单果重的变化与绿原酸、原花青素等酚类物质含量的变化呈显著或极显著负相关，认为果实重量的增加也可能是发育过程中多酚物质含量下降的原因之一。

本研究采用3种常见的酚类物质体外抗氧化活性测定方法（DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、铁离子还原/抗氧化能力）比较分析了3种苹果果实的抗氧化能力，这3种方法属于间接测定法，相比较直接测定法（氧自由基清除能力、NO清除能力、超氧阴离子清除能力等），操作上更加快捷、方便，且适用于大量样本［33］。结果发现，3种苹果果实的酚类提取物均具有一定的抗氧化能力，但不同品种间存在一定的差异，总体表现为山定子＞红满堂＞富士，3个苹果品种均对ABTS+自由基的清除能力较强。Li等［33］也表明ABTS+显示出与酚类浓度的最佳相关性。结合果实的整个发育过程来看，相比成熟果实，苹果幼果具有较强的抗氧化能力。果实的抗氧化性能是所含有的酚类物质共同作用的结果，王存堂等［34］研究表明总酚和总黄酮发挥着很重要的作用。本研究结果显示，红满堂的总黄酮含量与测定的3种自由基清除能力均极显著正相关，总酚含量与DPPH自由基清除能力极显著正相关，与ABTS+自由基清除能力和铁离子还原/抗氧化能力显著正相关；山定子的类黄酮含量与DPPH自由基清除能力显著正相关，与ABTS+自由基清除能力极显著正相关，但与铁离子还原/抗氧化能力不显著正相关；富士的总酚、类黄酮含量与3种自由基清除能力均极显著正相关。Boyer等［35］研究表明，与桃和梨相比，苹果含有更多的酚类化合物，具有更强的抗氧化能力。对杏［36］和芒果［37］的研究表明，不同基因型的总多酚和黄酮含量差异较大，且与总抗氧化能力高度相关，总抗氧化能力存在显著的基因型差异。Li等［38］研究发现欧李中酚类物质含量受基因型和环境显著影响。武悦等［39］在大豆中的研究同样表明，酚类物质与终止自由基的反应有关。Zheng［40］与Lee［41］等研究表明苹果的抗氧化和抗增殖活性是酚类物质协同作用的结果，除总酚、类黄酮以外，提取物中的其他物质也对抗氧化能力形成具有一定的贡献。

4 结论

苹果中的酚类物质含量和种类丰富。总体来说，幼果中的总酚、类黄酮、原花青素含量较高，而花青素含量则随着果实着色程度的增加逐渐升高；山定子和红满堂的黄烷醇含量以成熟期较高，而富士的黄烷醇含量以幼果期较高。不同苹果品种的酚类物质含量差异较大，常被用作砧木的山定子总酚、类黄酮、花青素、原花青素、黄烷醇含量高于其他两个品种，而红皮红肉的红满堂具有较高含量的花青素。3个苹果品种的抗氧化能力也具有一定差异，总体表现为山定子＞红满堂＞富士，且均对ABTS+自由基的清除能力较强。总酚、类黄酮及其他酚类物质与苹果果实的抗氧化能力具有较强的正相关性，充分证明酚类物质对抗氧化能力具有重要贡献。本研究结果可为开发山西省特有种质资源红满堂果实的功能成分奠定基础，为利用其抗氧化保健功能、培育高酚类苹果品种提供理论依据。