苹果半矮化砧木G.935的离体快繁体系建立

孙清荣，关秋竹，何平，李林光，王海波，陶吉寒，孙洪雁

（山东省果树研究所，山东 泰安 271000）

果树繁殖主要是通过把优良品种的接穗嫁接到适宜砧木上进行的，这种繁殖方式一方面保证了无性繁殖品种的稳定性，另一方面又可利用砧木的优良特性对接穗品种进行改良，提高其抗逆性、抗病虫能力及早实性，改善树体大小等［1-3］。另外，砧木还可影响接穗品种的基因表达模式［4］及抗或耐重茬性［5］。因此，在果树栽培生产上，砧木发挥着与品种同等重要的作用。而矮化砧木的育成与应用对现代化商业化果园的生产更有其特殊意义。矮化砧木可控制上部接穗品种树体的长势，使树体矮化，便于果园机械化管理；矮化还可加大种植密度，提高光能利用率和单产，从而提高经济效益。因此世界各国都非常重视矮化砧木的选育，不断有新品种育成。

苹果砧木G.935是美国康乃尔大学纽约Geneva实验站从Ottawa 3（抗冠腐和根腐病资源）×Robusta 5（抗火疫病资源）杂交种中选育出的半矮化砧木，具有高抗火疫病、耐重茬、高抗根腐病、耐寒等优良特性，生产效率相当于矮化砧木M9。现已引入我国，但尚处于试验观察阶段，还没有在生产上大规模推广应用。建立其离体快繁体系以快速获得优质种苗，可为其今后在栽培生产上的应用奠定基础，从而加速优良砧木推广。目前有关苹果半矮化砧木G.935组培快繁的研究国内外尚未见报道。本研究以G.935当年生新梢芽段为外植体获得无菌苗，然后以无菌苗为试材，设置不同的基本培养基和激素种类及浓度，对其增殖和生根培养条件进行优化，以建立其高效离体快繁技术体系，为今后推广应用及提供优良矮化砧木种苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山东省果树研究所天平湖试验基地嫁接种植的苹果半矮化砧木G.935小树。

1.2 试验方法

1.2.1 试管苗建立 2016年4月中旬，剪取当年新生的半木质化枝条，去掉叶片带回实验室；把枝条剪成一芽一段的芽段，参照孙清荣等［6］的方法进行消毒，然后接种到装有腋芽启动培养基的试管内，一管一个芽段，并置培养室诱导腋芽萌发至伸长生长形成无菌绿苗。腋芽启动培养基为MS+0.5 mg·L-16-苄基氨基嘌呤（6-BA）+0.1 mg·L-1吲哚丁酸（IBA）+0.3 mg·L-1赤霉素（GA3）。

1.2.2 增殖培养基优化试验 以无菌绿苗作为继代增殖的材料，设置4种培养基进行继代增殖：①MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA；②MS+1.0 mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA；③NM+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA；④NM+1.0mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA。每一个继代增殖周期为4周，统计每一个周期的试管苗增殖倍数，以继代培养3个周期的增殖倍数的平均值作为每一处理的增殖倍数，重复2次。

1.2.3 生根培养基优化试验 以继代增殖并伸长至1 cm以上的健壮绿梢为试材，设置不同培养基进行生根培养。基本培养基选用1/2MS和1/4MS，激素选用IBA和吲哚乙酸（IAA）并各设两个浓度，前者为0.2、0.4 mg·L-1，后者为0.5、1.0 mg·L-1，共构成8个处理。每个处理接种3瓶，每瓶种植10个绿梢，共计30个绿梢，作为一个重复，重复3次。接种后置于连续黑暗条件下培养1周，然后转光培养4周，统计生根梢数和单株生根数，计算生根率和平均每株生根数。

1.3 数据处理与统计分析

数据采用DPSv3.01软件进行统计分析，用最小显著差异（LSD）法进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 试管苗的建立

半木质化芽段在腋芽启动培养基上培养4周后萌发形成可用于继代繁殖的无菌试管绿苗（图1 A），腋芽萌发率在80%以上，表明所选启动培养基对苹果砧木G.935腋芽启动培养是有效的。

2.2 试管苗增殖培养基优化

四种培养基都能促进试管苗增殖，平均一个继代周期的增殖倍数都达到了4以上，不同培养基间差异不显著（表1）。但以MS为基本培养基的增殖倍数略高于以NM为基本培养基的。增殖苗在不同培养基上的生长表现不同：当添加0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA时，MS培养基上产生有明显节间伸长生长的绿苗（图1 B），而NM培养基上的增殖苗增高生长较差，没有明显的节间伸长（图1 D）；当添加1.0 mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA时，MS培养基上的增殖苗虽有节间伸长，但叶片卷曲不伸展，而且有玻璃化现象发生（图1 C），而NM培养基上的增殖苗节间伸长，叶片较伸展，没有玻璃化现象发生，但叶色较浅（图1 E）。表明，当BA和IBA浓度较低时，基本培养基MS更有利于增殖培养；但当BA和IBA浓度较高时，使用基本培养基NM更有利于获得正常生长的增殖苗。综合来看，以MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA进行增殖培养的效果最好。

表1 苹果半矮化砧木G.935试管苗增殖培养基优化试验结果

图1 G.935试管苗建立及在不同增殖培养基上的生长表现

2.3 试管苗生根培养基优化

2.3.1 不同培养基对试管苗生根率和单株生根数的影响 两种基本培养基上均以添加IBA的生根率和单株生根数较高，显著高于添加IAA的；基本培养基相同时，添加0.2 mg·L-1IBA的生根率和单株生根数高于0.5 mg·L-1IBA，在1/2MS上差异不显著，在1/4MS上差异达显著水平；IBA添加浓度相同时，以1/2MS为基本培养基的生根率和单株生根数均高于以1/4MS为基本培养基的，其中，生根率在添加0.5 mg·L-1IBA时差异达显著水平，单株生根数在两种浓度IBA下均差异显著（表2）。

表2 不同培养基上苹果砧木G.935试管苗的生根率和单株生根数

2.3.2 不同培养基对生根进程和途径的影响培养至第14天就可以观察到明显的小短根产生（图2 A～D），添加IBA培养基上的根（图2 A和C）比添加IAA上的根（图2 B和D）稍短，但单株根数较多。随着培养时间的延长，在添加IBA的培养基上既有根的伸长生长又有单株根数的增加（图2 E和F），而在添加IAA处理的培养基上仅有根的伸长生长，根数不再增加（图2 G和H）。

在添加IBA的培养基上诱导产生更多的愈伤（图2 A、C、E、F），推测IBA可能是先诱导出愈伤，再由愈伤产生根；而在添加IAA的培养基上根是从茎切面直接诱导产生的，不通过愈伤阶段（图2 B、D、G、H），所以其诱导生根进程更快，第14天时的根明显长。

图2 不同生根培养基对生根的影响

综合上述分析，适宜苹果半矮化砧木G.935的生根培养基为添加0.2 mg·L-1IBA的1/2MS或1/4MS培养基，尤以1/2MS+0.2 mg·L-1IBA最佳。

3 讨论与结论

植物试管苗增殖快繁的成败取决于培养基的组成，其中，基本培养基组分和外源植物生长调节物质是主要的影响因素［7］，在苹果砧木上的研究已有较多报道，但不同品种适宜的基本培养基和植物生长调节物质不同［8-16］。如适宜砧木54-118、JM7、GM256、Budagovsky71-3-150、Budagovsky60-160增殖培养的基本培养基为QL［10-12］；适宜砧木G.41的增殖培养基为同时添加1 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1TDZ的MS培养基，若单加BA则增殖率很低，若单加TDZ虽增殖率较高，但产生畸形叶和玻璃化苗［13］。本研究选用的试材砧木G.935与G.41的亲本之一都有‘Robusta5’，但适宜两者试管苗增殖的培养基不同，本试验中适宜G.935增殖的培养基为MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA。因此，苹果砧木试管苗的增殖快繁应针对不同品种选用其适宜的增殖培养基。

生根培养是离体快繁中关键的一步，直接影响工厂化繁育试管苗的成败。本试验选用的G.935是一个生根相对较易的品种，在1/2MS或1/4MS培养基中添加适宜浓度的IBA或IAA都能成功诱导试管苗生根，但以添加0.2 mg·L-1IBA的效果更好，生根率可达90%以上，单株生根6条以上，其中以1/2MS为基本培养基的效果好于1/4MS，这与孙清荣等［17］报道的BP-176砧木在1/2MS上的生根效果好于1/4MS一致。王淑华等［18］研究表明在‘嘎啦’苹果试管苗生根培养时IAA表现优于IBA和NAA；而吴玉霞等［19］在‘粉红佳人’试管苗生根培养时发现IBA比IAA明显提高生根率。不同品种对IAA的生根反应不同可能与不同品种梢基部的游离IAA水平不同有关。Alvarez等研究表明，相比M9，IAA诱导M26的生根率更高，其原因是M26比M9的梢基部含有更高水平的游离IAA［20］。

本研究建立了苹果优良半矮化砧木G.935的高效离体快繁技术体系：以当年新生的半木质化枝条为材料，以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1GA3作为腋芽启动培养基，获得无菌试管苗；再以试管苗为试材，用MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA进行增殖培养，用1/2MS+0.2 mg·L-1IBA进行生根培养，短时间内可获得规模无性繁殖的健康幼苗。这为今后推广应用半矮化砧木G.935奠定了技术基础。