TRPV3在单眼形觉剥夺性弱视大鼠视网膜节细胞中的表达变化

孙曼曼，高文涛，石冰涛

(河南医学高等专科学校基础医学部解剖教研室， 郑州 451191)

弱视的发病机制目前还不太明确。很多研究[6-8]报告指出，可能与下列分子表达的变化相关：神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)等神经生长因子、促生长因子(IGF)和其家族成员[9-10]、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bax 及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)等凋亡、抗凋亡相关的分子[11-12]眼优势柱出现偏移在单眼形觉剥夺中依赖三种激酶：Ca2+/钙调素依赖性、蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、胞外信号调节激酶(ERK)、依赖环磷酸腺苷的蛋白激酶A(PKA)等[13-14]。此外与在视觉发育关键期视觉传导系统视网膜、外侧膝状体、视皮质等部位神经元突触可塑性的变化[15-17]、树突棘的丢失[18]等变化有关。

瞬时受体蛋白香草酸亚型3(transient receptor potential vanilloid 3，TRPV3)属于TRP离子通道家族，属于非选择性阳离子通道，主要对钙离子有通透性，广泛表达于皮肤、舌、脊髓、脑等部位。其表达可以受很多因素的影响与调节，如温度、渗透压、pH值、机械力以及一些内外源性配体和细胞内外信号分子。目前发现在介导感觉信号的传递、炎症反应、细胞增殖分化、肿瘤发生发展等中有重要作用。而目前关于TRPV3在视觉传导系统中的表达及作用，尚未见报道。本实验通过建立形觉剥夺性弱视大鼠模型，利用免疫组织化学和蛋白质免疫印迹(western-blot，WB)技术来研究剥夺性弱视大鼠视网膜节细胞TRPV3蛋白的变化规律，探讨其在弱视发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 生后2周龄SD大鼠36只(体质量无要求)，雌雄不限，随机分为实验组和正常对照组，经实验动物管理委员会批准。动物是由河南医学高等专科学校实验动物学部提供并在其寄养，动物房的相对湿度控制在40%～50%，温度保持在20～24 ℃，12 h昼夜节律(光照时间8:00-20:00)自由饮水和进食标准的大鼠饲料，实验方法严格按照国家研究院批准的实验动物护理和使用健康指南。主要试剂：兔抗大鼠TRPV3抗体(由Alomone提供)、生物素化广谱IgGPAN和三抗ABCkit(由Vector lab提供)、DAB显色试剂盒(由北京中杉金桥生物技术有限公司提供)、荧光驴抗兔IgG488(Jackson)Anti-GAPDH、HRP-conjugated anti-rabbit、HRP-conjugated anti-mouse(由碧云天提供)。

1.2 方法

1.2.1 实验方法

1.2.1.1 动物模型的建立 实验组大鼠腹腔注射质量分数4%水合氯醛0.2～0.3 mL，全身麻醉固定，剪除眼周多余毛发，碘附消毒眼周，剪除左眼上下睑缘1.0～2.0 mm，缝合眼睑，术后1周每日抗生素眼液滴眼。术后每日检查缝线是否脱落，如有脱落则弃之不用。

1.2.1.2 灌注固定和取材 4周后进行灌注固定和取材，质量分数4%水合氯醛全身麻醉后开胸，充分暴露心脏，将灌注头由心尖处插入左心室并送入主动脉内，剪开右心耳。快速灌注磷酸缓冲盐溶液(PBS) 300 mL，再灌注体积分数4%多聚甲醛溶液200 mL，先快后慢。灌注完成后取双侧眼球。标本分为正常对照组、实验组，正常对照组剥夺侧眼，实验组未剥夺侧眼，将取出的眼球剪除，角膜和晶体，后浸入体积分数4%多聚甲醛溶液(40 g PFA/1 000 mL)中4 ℃过夜，梯度沉糖(15%蔗糖、30%蔗糖)，包埋，然后迅速放入-80 ℃冰冻保存。恒冷冰冻切片机调至-25 ℃，切片厚度调至10 μm，进行连续眼球切片。苏木精-伊红染色(HE染色)：将切好的片子在蒸馏水中洗涤2 min，苏木素染色液染色1 min，浸自来水中冲洗去多余的染色液，蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟)。伊红染色液染色1～2 min，脱水、透明、封片。

1.2.2 免疫组织化学 室温下孵育盒里孵育质量分数3%医用过氧化氢(H2O2) 30 min，室温下孵育盒里孵育体积分数10%马血清封闭2 h，1∶100的比例加入兔抗TRPV3(阴性对照组以1∶1的比例加入内源性抗原肽和一抗混合物)，1∶400的比例加入生物素标记的抗兔的二抗， 1∶400比例加入ABC复合物(A、B液应提前30 min配置混匀)，DAB显色，晾干。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片晾干，在光镜显微镜下阅片、拍照。

1.2.3 免疫荧光染色 将室温下孵育盒里孵育质量分数3%H2O230 min，室温下孵育盒里孵育体积分数10%马血清封闭2 h， 1∶100的比例加入兔抗TRPV3， 1∶300的比例加入荧光二抗，避光下加入DAPI，在荧光显微镜下阅片、拍照。

需求分析的缺失还表现在教材质量参差不齐。目前我国图书市场上不乏各种专业ESP教材，但这些教材在内容的系统性和时效性上不突出，表现为缺乏真实场景的语言训练，不利于学习者语用能力的发展。以商务英语教材为例，在教材中没有对语言输出和与专业结合的交际能力的训练，直接影响学生语用能力的培养和教学效果。再看科技英语教材，文章加练习的传统精读教材的编排格式，体现科技英语的地方就是文章是科普类文章。人的认知能力和语言能力应互为促进，学习者专业语言能力应通过教材的学习得到发展。ESP教材单薄的设计没有体现专业英语的语用功能，也不能满足学生对科技英语学习的要求。

1.2.4 WB实验 变性蛋白跑胶1.0～1.5 h，110 V，后进行转膜，2.5 h，60 V。10%脱脂奶粉封闭过夜，以1∶200的比例加入兔抗TRPV3(内参条带加入1∶2 000的鼠抗GAPDH)，以1∶2 000的比例加入辣根过氧化物酶标记的抗兔的二抗(内参条带加入抗鼠二抗)，暗室进行显影。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件分析数据，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜HE染色 实验组缝合侧眼视网膜HE染色与对侧(未缝合)比较：细胞层次结构更紊乱，细胞形态不规则，节细胞层细胞数目变少，细胞核染色更深(图1A、B)。提示单眼形觉剥夺性弱视大鼠视网膜存在细胞损伤或者细胞数目的减少。

图A 实验组形觉未剥夺侧视网膜HE染色(nondeprived eyes,ND)；图B 实验组形觉剥夺侧视网膜HE染色(monoculardeprived eyes ,MD)；箭头指示视网膜神经节细胞层。

2.2 免疫组织化学 光学显微镜下，大鼠视网膜阳性细胞胞膜呈棕褐色，胞浆着色较浅或不着色(图2 A、B、C)，阴性对照未见特异性染色(图2D)，实验组视觉剥夺眼阳性细胞染色较淡，平均阳性细胞数与实验组未剥夺眼和正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而正常对照组和实验组未剥夺眼比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图2E)。

2.3 免疫荧光 荧光显微镜下，大鼠视网膜阳性细胞胞膜显示绿色荧光，细胞核显示蓝色荧光。(图3 A、B、C)

图A正常对照组;图B实验组未剥夺眼视网膜(ND);图C实验组形觉剥夺眼视网膜(MD);图D阴性对照组。箭头指示视网膜神经节细胞层阳性细胞。INL:内核层，ONL:外核层。图E为统计图:实验组剥夺眼视网膜节细胞与对侧眼视网膜节细胞和正常对照组视网膜节细胞比较，TRPV3蛋白的表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05); 实验组未剥夺侧眼视网膜节细胞与正常对照组视网膜节细胞比较，TRPV3蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图A正常对照组；图B实验组未剥夺眼视网膜；图C实验组形觉剥夺眼视网膜。箭头指示视网膜神经节细胞层。

2.4 WB 将正常对照组和实验组视网膜蛋白提取出来进行WB实验检测，结果表明，TRPV3分子免疫印迹阳性条带出现位置与抗体说明书上提供的阳性参考条带所在位置一致。与实验组未剥夺眼和正常对照组比较，实验组视觉剥夺眼的阳性条带明显变窄(图4 A)。统计分析显示,实验组视觉剥夺眼与实验组未剥夺眼和正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而实验组未剥夺眼与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图4 B)。

图4 SD大鼠视网膜TRPV3蛋白WB显影表达变化

3 讨论

目前,对于弱视病因和发病机理研究的认识，主要来自动物模型组织学和生理学的研究观察或对患儿临床观察及电生理功能异常的检测,弱视模型可以在视觉发育敏感期高峰由缝合单眼眼睑所诱导形成[19-20]。但由于各种外在因素的影响,其研究结果可能存在异议。但是普遍观点认为，弱视是一种从视网膜节细胞至视中枢的整个视觉传导系统的功能及形态学异常引起的临床症候群。

本实验观察到TRPV3蛋白存在于视网膜这一高度特化的组织结构内,主要定位于视网膜神经节细胞层细胞胞膜内。视觉发育关键期大鼠一侧眼持续4周在黑暗条件下与对侧眼及正常对照组比较,图A为TRPV3在SD大鼠视网膜的WB条带，nor为正常对照组，ND为实验组未剥夺眼，MD为实验组形觉剥夺眼。图B为统计图。实验组剥夺眼视网膜节细胞与对侧眼视网膜节细胞和正常对照组视网膜节细胞比较，TRPV3蛋白的表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；而实验组未剥夺侧眼视网膜节细胞与正常对照组视网膜节细胞比较，TRPV3蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

其视网膜中TRPV3蛋白表达明显减少，而视觉发育关键期结束后的大鼠一侧眼视觉剥夺4周与对侧眼比较，视网膜中TRPV3蛋白表达无明显差异。由此提示,TRPV3蛋白可能参与视觉发育关键期内的视觉发生发展等视觉过程。TRPV3蛋白表达减少可能是由于在黑暗环境中,视觉信息减少而使TRPV3蛋白表达受到抑制所致。

TRPV3最初研究[21-23]发现扮演着温度感受器的功能，在一定温度(31～39 ℃)下被激活。TRPV3的激活可以使胞质内的钙离子浓度增高，钙离子是细胞内普遍存在的第二信使，参与细胞内的很多信号级联反应，从而调节细胞的生长增殖等过程。笔者猜测在视觉发育关键期，一侧眼视觉刺激的减少，使TRPV3表达受抑制，可能使细胞内钙离子浓度发生改变，从而影响视网膜神经细胞的生长增殖等，最终可能引发弱视的发生发展。

根据本实验结果推测，在视网膜神经节细胞发育过程中，TRPV3可能参与调节其发育、分化生长或凋亡。当视觉发育关键期内长期形觉剥夺使剥夺眼所支配的视觉系统神经元在与对侧眼占据突触位点竞争中处于劣势时,视网膜神经细胞TRPV3蛋白的表达降低，可能导致了Ca2+在节细胞的运输障碍，从而影响视网膜神经细胞的生长发育和功能发挥，可能是弱视发生发展的机制之一。至于TRPV3蛋白在视网膜节细胞发育的不同阶段的表达变化及其在弱视发生中的详细机制还有待深入研究。本研究结果表明，视觉发育关键期内单眼形觉剥夺性弱视动物模型的视网膜神经细胞TRPV3蛋白表达降低,提示TRPV3蛋白可能是弱视发生的分子生物学基础之一。