NDUFA4L2在胶质瘤组织中的表达及意义

李春芽， 陈远兵， 梁银华， 唐 淼， 曹武阳

胶质瘤是中枢神经系统常见的原发性恶性肿瘤，占中枢神经系统恶性肿瘤的80%，年发病率约为6.6/10万[1-2]。目前，最大安全范围内的手术切除肿块是胶质瘤最有效的治疗方式。而胶质瘤位于中枢神经系统，具有局部侵袭和破坏神经功能区的特点，手术全切困难且易复发，使其具有较高的致残性和致死性，整体5年存活率约为35%[3]。迄今为止，虽然有部分分子能够有效预测患者的预后[2，4-6]，但胶质瘤仍缺乏特异性的分子标志物用于准确判断患者预后以及作为靶向治疗的有效分子靶点[7]。因此，进一步探索胶质瘤预后的分子标志物及潜在的分子治疗靶点具有重要的临床意义。脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)损伤在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，且在相关研究中均提示DNA损伤的调控也参与肿瘤的治疗抵抗，故有必要针对参与DNA损伤的分子进行研究[8-10]。而乳酸脱氢酶A的α复合体4-L2[NADH dehydrogenase(ubiquinone) 1 alpha subcomplex 4-like 2，NDUFA4L2]是线粒体中电子传输链(electron- transport chain，ETC)复合物I亚基的一个组成部分，在缺氧环境中高度表达，同时也是缺氧诱导因子的下游靶基[11]。且NDUFA4L2可以介导线粒体中的氧化磷酸化和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，并且NDUFA4L2蛋白能够抑制癌细胞中ROS的生成，从而发挥抗氧化应激的作用，进而保护由ROS诱导的DNA损伤[8，12]。目前，在骨肉瘤、肺癌、肾细胞癌、结肠癌、肝癌等恶性肿瘤的研究中，均发现NDUFA4L2发挥癌基因的功能作用[8，12-16]。然而，目前鲜见NDUFA4L2在胶质瘤中的相关研究。因此，为明确NDUFA4L2在胶质瘤中的作用，本研究通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和中国胶质瘤基因组图谱(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)数据库分析胶质瘤组织中NDUFA4L2的表达，探讨NDUFA4L2与患者临床病理分级的相关性，并通过收集临床资料进行验证，从而探讨其临床诊断及预后判断价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2017年1月至2019年6月在中南大学湘雅医院神经外科手术切除并经术后病理组织学检查确诊为胶质瘤的脑胶质瘤组织标本62例，在组织获取后立即冻存于-80 ℃冰箱备检。同时收集相应患者的临床资料，并开展临床随访。本研究获得了所有患者的书面知情同意及中南大学湘雅医院伦理委员会的批准。

1.2生物信息学分析 本研究中生物信息学分析的相关数据均来自以下公共数据库网站：TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)和CGGA(http://www.cgga.org.cn/)。通过下载数据，然后将基因表达量与对应的临床信息进行匹配。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)病理分级系统可将其分成Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级，然后提取相对应患者的NDUFA4L2表达量进行统计分析，同时分析NDUFA4L2表达量对患者生存期的预测价值。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)检测 将胶质瘤组织、切碎、研磨，加入1 ml Trizol裂解组织，并按Trizol抽提总RNA的试剂盒(Invitrogen公司)说明书提取总RNA。使用反转录试剂盒(TaKaRa)将总RNA反转录为cDNA。再使用RT-PCR仪进行检测，设定RT-PCR的运行程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min 35个循环，以β-actin作为内照。RT-PCR引物序列：NDUFA4L2正向引物：5′-CTGGGACAGAAAGAACAACCCG-3′，反向引物：5′-CAGCCTGGCTTAGAAGTCTGGC-3′；β-actin正向引物：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′，反向引物：5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′。

1.4免疫组织化学法检测 切取脑胶质瘤组织的石蜡包块制备病理切片，并进行烤片，后置于枸缘酸钠缓冲液中加热行抗原修复，加入3%过氧化氢溶液中以灭活内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)冲洗3次。然后孵育NDUFA4L2一抗(Proteintech公司；兔源性，1∶400稀释)，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗3次，加入二抗，室温反应90 min，再以PBS冲洗3遍，最后进行染色、脱水、封片。

1.5随访 采用电话沟通的方式进行随访。总生存期(overall survival，OS)为手术时间至最后随访日或死亡时间。

2 结果

2.1NDUFA4L2在胶质瘤中的表达水平 在TCGA和CGGA数据库中，胶质瘤组织中NDUFA4L2 mRNA的表达水平随着WHO分级的增高而明显升高(图1ⓐⓑ)。62例胶质瘤组织样本(包括WHO Ⅱ～Ⅳ级)的RT-PCR检测结果也显示，NDUFA4L2 mRNA也随着胶质瘤WHO分级的升高而上调(图1ⓒ)。应用免疫组织化学法检测不同级别胶质瘤样本(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级)中的NDUFA4L2蛋白表达情况，发现NDUFA4L2蛋白的表达随着胶质瘤WHO分级的升高而上调(图2)。

图1 NDUFA4L2 mRNA在各级别胶质瘤中的表达水平比较图

ⓐWHO Ⅱ级；ⓑWHO Ⅲ级；ⓒWHO Ⅳ级

2.2NDUFA4L2在胶质瘤中的表达水平与预后的关联性 对TCGA和CGGA数据库所获取数据进行分析，结果显示，高NDUFA4L2 mRNA表达的胶质瘤患者其OS较短(P<0.05)(图3ⓐⓑ)。同样的，针对临床数据分析发现，NDUFA4L2 mRNA低表达者其OS更长(P<0.05)(图3ⓒ)。

图3 高、低NDUFA4L2 mRNA表达水平胶质瘤患者的生存曲线图

3 讨论

3.1胶质瘤是中枢神经系统肿瘤，具有侵袭性生长的特点，从而破坏或影响神经系统功能，有较高的致死性和致残性[17]。从恶性程度来分析，胶质瘤作为脑肿瘤中恶性程度高、侵袭能力强的中枢系统肿瘤，具有高浸润性、瘤内异质性、增殖速度快及易复发等特点[18]。WHO分级系统是目前胶质瘤恶性程度以及预后判断的经典方法，但是仍有一定的局限性[19]。近年来，分子靶向治疗在癌症治疗中越来越重要，尤其在肺癌的分子靶向治疗中[20]。因此，为胶质瘤的诊疗及预后判断寻找新的分子治疗靶点具有重要的临床意义。本研究发现NDUFA4L2的表达量与胶质瘤的恶性程度及预后相关。

3.2已有研究证实，NDUFA4L2在相关肿瘤中呈高表达，其表达与肿瘤的进展和预后相关，提示NDUFA4L2可能是一种有应用前景的肿瘤标志物[8，14-16]。本研究发现NDUFA4L2表达水平随着胶质瘤WHO病理分级的增高而升高，表明NDUFA4L2的表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关。提示NDUFA4L2表达水平与胶质瘤的恶性进展有关，故有望通过检测胶质瘤中NDUFA4L2的水平来协助评估胶质瘤的恶性程度。本研究的免疫组织化学检测结果显示NDUFA4L2主要分布在胞浆中，而相关研究显示NDUFA4L2主要位于线粒体并影响细胞的氧化磷酸化和ROS的产生[11-13]，也进一步证实NDUFA4L2在胶质瘤中也可能通过影响线粒体电子传递进而影响能量转化以及抗氧化应激，最终影响胶质瘤的发生发展。因此，有可能通过靶向NDUFA4L2来影响胶质瘤的能量代谢及抗氧化应激能力，从而抑制胶质瘤的进展。

3.3本研究发现NDUFA4L2不但与胶质瘤的病理分级相关，还与患者预后相关。NDUFA4L2的表达量越高，则胶质瘤患者的预后越差，这可能与NDUFA4L2影响胶质瘤能量代谢和抗氧化应激能力相关。当NDUFA4L2改变胶质瘤细胞的能量代谢，同时提高胶质瘤的氧化应激能力后，就会促进胶质瘤的快速生长，从而增加患者的瘤负荷压力，最终影响胶质瘤患者的生存期。因此，NDUFA4L2有望作为胶质瘤患者预后的分子标志物，可通过检测NDUFA4L2的表达量来协助预测胶质瘤患者的生存期。

综上所述，NDUFA4L2有望成为胶质瘤分级及预后判断的肿瘤标志物，在后续研究可以进一步针对NDUFA4L2展开深入的研究，并设计靶向药物进行临床应用。