基于网络药理学及分子对接技术探讨清解化攻方治疗重症急性胰腺炎的作用机制

秦百君， 江柳庆， 陈 蕊， 杨 昕， 谭 琦， 黄梦瑶， 刘锟荣， 陈国忠

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是由多种病因引起的胰蛋白酶异常激活、胰腺组织水肿、坏死及炎症介质大量释放，继发全身炎症性反应综合征和多器官功能障碍综合征的急危重症[1]。研究[2]表明，SAP约占急性胰腺炎患者的20%，死亡率达6.5%～26.0%，以发病2周内的病死率较高。近年来，结合该病病情进展快速、预后凶险等特点，医师们提出了多学科联合诊疗(multi-disciplinary team,MDT)模式，尽早介入治疗以降低病重率和病死率，这已成为现行主流的治疗模式[3]。中医药可在SAP的预防和治疗中发挥积极作用，在改善肠梗阻、减少炎症因子释放、抑制肠道菌群移位等方面具有良好疗效[4]，为中西医协同诊治重大急危重症发挥了重要作用。本研究团队认为，SAP多由情志不遂，暴饮暴食、嗜食辛辣炽馎、肠虫妄动等引起，临床表现可归为“胰瘅”“脾心痛”“结胸”等，在《黄帝内经》和《圣济总录》中也均有相关论述[5-6]。本病病机为“湿热瘀毒”，故提出“清热化湿解毒、化瘀攻下存阴”的治则，临证用药主张在SAP早期结合西医高强度治疗基础上，及时用中药清解化攻湿热毒瘀，予邪出路[7]。清解化攻方是陈国忠教授治疗SAP数十年探索总结而成的临证验方，是“清热化湿解毒、化瘀攻下存阴”治法的代表方剂[8-9]。本研究借助网络药理学方法初步探索了清解化攻方治疗SAP的作用机制，并利用分子对接验证和模拟了药效成分和疾病靶点的作用模式。

1 资料与方法

1.1清解化攻方成分及作用靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以生物利用度>30%、类药性>0.18为条件筛选清解化攻方中药活性成分，并命名为“ingredients.txt”文件；检索本方剂所含药物的潜在靶点，命名为“target.txt”文件。

1.2中药靶点基因注释 在uniprot网站(http://www.uniprot.org/)勾选Reviewed Human基因选项，将“target.txt”文件靶点信息转换为对应的基因名称，命名为“symble.txt”文件。

1.3疾病相关基因检索 通过GeneCards(www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、pharmgkb(www.pharmgkb.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)数据库，以“severe acute pancreatitis”为关键词检索，得到疾病基因集，命名疾病基因文件“Disease.txt”。

1.4中药复方调控网络图构建 对清解化攻方的药物靶点和SAP的疾病基因取交集：将方法1.2中的“symble.txt”文件和1.3中的“disease.txt”文件通过R语言VennDiagram包进行运算，得到交集基因列表“drug-disease.txt”文件，并绘制韦恩图。应用Cytoscape3.7.2软件对交集基因构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。

1.5蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络图构建 在String网站(http://string-db.org)点击“Muitiple proteins”，物种选择“Homo sapiens”，置信度设置为“>0.90”，删除游离节点，导入交集基因列表(即方法1.4的“drug-disease.txt”文件)输出结果，命名为“string_interactions.xls”文件。

1.6GO和KEGG富集分析 应用CytoNCA行拓扑学分析，以网络节点度(degree)、介数中心度(betweenness，BC)和接近中心性(closeness，CC)为节点关键指标，筛选大于三者中位数的成分作为核心靶点基因；通过DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对核心靶点进行GO富集分析，P<0.05；应用R软件“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”包对交集基因进行KEGG富集分析，P<0.01。

1.7分子对接技术 通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载清解化攻方药物关键成分的小分子结构(拓扑学分析排名前三)，应用Chem3D软件将小分子配体结构优化，并转换为3D结构。通过蛋白数据库(protein data bank,PDB;https://www.rcsb.org)检索药物核心靶点的三维结构(PPI网络中排名前三)。应用Autodock Vina软件对小分子配体和蛋白受体分子对接。

2 结果

2.1清解化攻方的活性成分 通过TCMSP数据库收集到清解化攻方10味药物的共202个化合物。药物靶点经Uniprot基因注释后得到225个注释基因。见表1。5个数据库收集到6 522个疾病基因，并将药物靶基因和疾病靶点取交集，最终得到210个药物-疾病交集基因。见图1。

表1 部分药物活性成分及靶点信息

图1 药物-疾病韦恩图

2.2“药物-成分-靶点-疾病”网络及关键药物成分

网络共402个节点，其中药物成分节点156个，靶基因节点246个，1 925条边见图2。清解化攻方中节点度值最高的药物成分包括(排名前10)：槲皮素(degree=131个)、木犀草素(degree=56个)、山柰酚(degree=49个)、汉黄芩素(degree=39个)、丹参酮Ⅱa(degree=37个)、柚皮素(degree=35个)、川陈皮素(degree=29个)、黄芩素(degree=29个)、β-谷甾醇(degree=30个)及二氢丹参酮(degree=26个)。提示这些药物成分在清解化攻方治疗SAP过程中可能发挥了关键作用。

黄色代表靶基因，蓝色代表有效成分，紫色代表药物。体现了复方多成分、多靶点的特点

2.3蛋白互作用PPI网络及核心靶点 蛋白互作用PPI网络图。见图3。核心靶点的BC、CC、degree拓扑学分析，按中位值进行过滤，重复2次，得到PPI网络图共14个节点，50条边。提示该14个靶点可能是清解化攻方干预SAP发挥关键药效作用的潜在靶点。见表2。

图3 PPI网络图

表2 PPI网络排名前10关键靶点及拓扑参数

2.4潜在靶点通路富集分析结果 GO富集分析得到GO条目2 778个，其中生物过程2 423个，细胞组成112个，分子功能243个。见图4。药物成分主要富集在细胞对药物反应、脂多糖反应、氧气反应等过程。细胞组成涉及到细胞膜筏、受体复合体、转录因子复合体等。分子功能包含转录因子活性及配体调节特异性DNA结合序列、G蛋白偶联的胺受体活性等。KEGG预测靶点的通路共包括118条代谢通路，选取P<0.01，且富集数目>20的通路绘制气泡图，结果显示通路主要与代谢、炎性因子以及细胞凋亡等相关。见图5。

图4 GO富集气泡图

图5 KEGG富集气泡图

2.5分子对接结果 在“药物-成分-靶点-疾病”网络中，槲皮素、木犀草素、山柰酚等是清解化攻方作用于SAP的关键药效成分团，JUN、TP53、STAT3是PPI网络排名前三的核心基因。应用Autodock软件对接每种构象得到20个不同组合，选择结合能最低的组合作为分子对接构象，见图6。经计算得到JUN、TP53、STAT3靶点与3种关键成分的最低结合能均小于-7 kcal/mol，显示出强烈的结合活性和稳定构象。药效成分、作用靶点、氢键结合能见表3。

表3 分子对接结果

图6 分子对接图

3 讨论

3.1广西地处亚热带区域，气候炎热潮湿，人体脾胃若伤，湿邪内外相合，据不同体质和时令从化而发生急性胰腺炎。据此，陈国忠教授提出清、解、化、攻治法，针对性治疗早期SAP的“热、毒、湿、瘀”浊邪，以尽快疏调体内气机，减轻毒邪败坏脏器，防止由闭转脱，与《急性胰腺炎中医诊疗专家共识意见(2017)》[10]提出SAP初期治则理论相契合。清解化攻方由柴胡、黄芩、大黄等10味中药组合，以通腑泻浊的小承气汤为基础，配理气化湿、活血祛瘀、清热解毒药。陈国忠教授遵从张介宾之祛邪即是扶正，并结合其根本病机[7]：人体气机受阻，瘀血内生，酿生湿热，湿热瘀浊不去，耗气灼津，肠腑不通，日久成毒，用药祛邪之品如大黄、黄芩等量适度，理在勿大砍大伐，防邪未去而正已伤。理气行气柴胡、厚朴、广木香与活血化瘀桃仁、丹参合用，气行则血行，气血同调，但用药中也当防其辛燥之性化热伤阴，用量宜小。方中枳实、豆蔻化湿宜重用，意为湿去则热孤。全方共奏清热化湿、解毒化瘀功效。本方药物辛燥苦寒，当中病即止，以防变证[11]。

3.2网络药理学是从整体层面探索药物和疾病相关性的研究方法，通过生信分析系统揭示药物干预疾病的多靶点、多通路机制，为中医药现代化研究提供了新的思路和方法[12-13]。本研究基于该方法筛选到清解化攻方含槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素等关键成分。槲皮素是多羟基黄酮类化合物，具有抗氧化清除自由基，抗炎、免疫调节等作用，可通过抑制炎性因子NF-κB表达及活化发挥治疗胰腺炎的作用[14-15]。木犀草素是黄酮类化学物，通过降低p-P38蛋白表达，抑制NF-κB和p38MAPK通路激活，发挥对胰腺的保护作用[16]。山萘酚具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种药理活性[17]，可保护胰腺免受炎症损害。拓扑学分析清解化攻方治疗SAP的14个潜在作用靶点，包括JUN、TP53、STAT3等，主要参与细胞增殖、凋亡、分化、炎症反应等过程。JUN在转导偶联信息传递过程中发挥信使作用，可调节基因表达，并作为基因调节蛋白调节靶基因转录而诱导细胞凋亡[18]。STAT3作为多种细胞因子诱导的胞质蛋白，已被证实可由炎性因子激活后通过STAT3通路对抗胰腺腺泡细胞凋亡或延迟炎症细胞修复来加重急性胰腺炎[19]，D Oliveira Martins等[20]也论证了TP53基因变异与SAP易感性存在潜在关联。

3.3本研究GO富集分析结果显示，清解化攻方可参与炎症反应、细胞凋亡、活性氧代谢等过程，KEGG主要富集于P53、HIF-1、TNF、PI3K-Akt等信号通路。胰腺炎症及全身炎性反应综合征是SAP发病的重要特征，PI3K-Akt可通过磷酸化NF-κB的上游IκB激酶复合体，使抑制蛋白IκB降解，引起NF-κB释放活化，从而转录调控大量炎性因子的表达，引发疾病[21]。一项地塞米松治疗SAP的研究[22]也发现，地塞米松通过抑制丝裂原激活蛋白激酶NF-κB信号转导与转录激活子3信号途径而减少炎性因子和趋化因子释放，从而降低SAP的严重程度。PI3K/Akt信号通路也参与了细胞凋亡，可通过激活NF-κB调节凋亡相关基因的表达活性而抑制凋亡。Wang等[23]的研究通过抑制SAP大鼠的PI3K通路，使得NF-κB活性降低，凋亡抑制基因表达和炎症因子释放减少，大鼠的病情得到减轻。本研究分子对接结果显示，槲皮素、木犀草素与JUN、TP53、STAT3等受体具有良好的结合性，说明清解化攻方可能通过调控P53、PI3K-Akt等信号通路发挥抗炎、调节细胞凋亡、改善能量代谢等作用，提示清解化攻方具有多靶点和多通路治疗SAP的特点。

综上所述，本研究借助网络药理学和分子对接初步探讨了清解化攻方的活性成分和潜在靶点，及多通路、多靶点协同治疗SAP的复杂网络机制，为后续深入研究清解化攻方治疗SAP的作用机制提供参考，但研究结论仍需进行实验研究进一步验证。