西瓜噬酸菌hpaB基因的功能研究

张美玉，费诺亚，郭彦彤，田二渊，季苇芹，张晓晓，杨玉文，关 巍，赵廷昌

（1.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳110161；2.中国农业科学院 植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193；3.吉林农业大学 农学院，长春130118）

瓜类细菌性果斑病是一种重要的检疫性、种传病害，其病原菌为革兰氏阴性菌——西瓜噬酸菌[1]。该病害在全世界范围内发生，种子带菌为该病害主要的初侵染源[2]，主要为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物，严重限制了瓜类产业的发展，造成巨大的经济损失[3]。目前西瓜噬酸菌的致病机理尚不完全明确，防治方法主要是对种子进行化学药剂处理，但针对性和有效性不佳[4-5]，因此对西瓜噬酸菌致病机理进行研究是必要的。

Ⅲ型分泌系统广泛存在于植物病原细菌中，由h r p基因簇编码，是细菌致病力的主要决定因素[6-7]。根据基因含量、操纵子的组织和调控，将h rp簇分为两类，Ⅰ类包括丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）和肠杆菌科（Ent erobact eriaceae）的植物病原菌，Ⅱ类包括黄单胞菌属（Xanthomonasspp.）、青枯菌（Ralstonia sol anacearum）和噬酸菌属（Acidovoraxspp.），西瓜噬酸菌hr p基因簇的类型归为Ⅱ类[7-8]，其结构特点与黄单胞菌属类似。近年来，已经有大量关于植物病原细菌T3Es功能的研究[9-11]，但目前有许多研究集中在III型分泌伴侣蛋白及III型分泌系统相关蛋白的功能上[12-14]。

hpaB基因是植物病原细菌III型分泌系统h r p基因簇中的重要组成部分，其编码的蛋白质可能具有伴侣蛋白功能。据报道在青枯菌和野油菜黄单胞菌中T3Es的分泌依赖HpaB，植物病原菌通过将T3Es注入植物细胞发挥其致病性，这种机制部分受III型伴侣蛋白控制[15-16]。生物信息学分析可知，西瓜噬酸菌野生型菌株Aac5中存在h pa B基因，为探究hpa B基因在西瓜噬酸菌致病性中的作用，明确该基因缺失后，对西瓜噬酸菌致病力和其他致病相关表型的影响，从而为更好地防治瓜类细菌性果斑病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试西瓜（Citrull us l anatus）品种为中蔬瑞宏；甜瓜（Cucumis meloL.）品种为中蔬甜瓜TVF192；烟草品种为三生烟（Nicoti ana tab acumvar.Samsun）。供试菌株有Aac5菌株（野生型菌株，氨苄青霉素抗性）、Δh pa B（野生型菌株Aac5缺失h paB基因的突变菌株，氨苄青霉素抗性）、Δh paBcomp（ΔhpaB突变菌株互补hpaB基因，氨苄青霉素抗性，卡那霉素抗性）和大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α（天根）；供试质粒有pK18mobsacB（含有sacB蔗糖致死位点的自杀性载体，卡那霉素抗性）、pBBR1MCS-2（含lac启动子的广泛宿主表达载体，卡那霉素抗性）、pRK600（三亲本杂交中的辅助菌株，氯霉素抗性）、pK18-hpa B（用于构建突变菌株Δh pa B的自杀性重组载体，卡那霉素抗性）和pBBR-hpa B（具有hpa B基因片段的pBBR1MCS2载体用于构建互补菌株Δh paBcomp，卡那霉素抗性）。

试验所用的仪器主要有低温离心机（Eppendorf）、凝胶成像分析系统（BIO-RAD）、PCR仪（BIO-RAD）、分光光度计（Thermo Fisher Scientific）、核酸蛋白分析仪（Thermo Fisher Scientific）、全自动生长曲线分析仪（Biosceen）、荧光定量PCR仪（Agilent AriaMx Mx3000P）等。

试验所用的试剂主要有细菌基因组DNA提取试剂盒（BioTeke）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（Axygen）、质粒小提试剂盒（Axygen）、PCR清洁回收试剂盒（Axygen）、KOD高保真酶（TOYOBO）、Infusion无缝连接酶（Vazyme）、核酸限制性内切酶（TaKaRa）、反转录试剂盒（天根）和SuperReal PreMix（SYBR Green，天根）。试验中所有引物的合成和测序工作均交由华大基因（北京）科技有限公司完成。

试验所用的培养基有KB培养基（胰蛋白胨20g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g，丙三醇15mL，pH=7.0）和LB培养基（酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，pH=7.0）；供试T3SS诱导培养基[20]（酵母提取物2.5g、胰蛋白胨5g、氯化镁1.015g、氯化钠2.5g，pH=5.8），加入蒸馏水定容至1 L即为液体培养基，在相应的固体培养基配制时，加入20 g的琼脂粉；0.3%半固体培养基（酵母提取物0.3g，细菌蛋白胨0.3g，琼脂粉3 g，pH=7.0）。M9蔗糖培养基，预配制400mL 5×M9溶液（磷酸氢二钠30.2414g，磷酸二氢钾6g，氯化铵2g，氯化钠1g），再配制200mL 5×M9溶液，1g·mol-1硫酸镁溶液1mL，20%柠檬酸钠溶液10mL，110℃高温灭菌，时间15min。

培养条件：大肠杆菌E.coliDH5α的培养条件为37℃，LB培养基；其他供试菌株均为28℃，KB培养基。试验中所用的抗生素及浓度：卡那霉素，浓度为50μg·mL-1；氨苄青霉素，浓度为100μg·mL-1；氯霉素，浓度为50 μg·mL-1。

1.2 方法

1.2.1hpa B基因缺失突变菌株的构建及验证 登录NCBI数据库查找Acidovorax ci trulliAAC00-1全基因组序列，获得hpa B基因（Aave_0446）序列，利用Premier 5.0软件设计引物。使用的模板为西瓜噬酸菌Aac5基因组DNA，KOD高保真酶分别扩增hpaB基因上下游片段，并将其进行连接[21]，然后连接于双酶切处理的pK18mobsacB质粒中，获得自杀性重组载体pK18-hpa B，将其导入大肠杆菌感受态细胞中。采用三亲杂交的方法，将自杀性重组载体pK18-hpa B导入野生型菌株Aac5中，突变菌株的筛选根据同源重组原理[22]，使用西瓜噬酸菌特异性引物WFB1/WFB2[23]、目的基因特异性引物hpa B-TF/TR进行PCR验证，并测序验证，获得正确的突变菌株Δhpa B。连续继代培养，保证突变菌株的遗传稳定性。引物见表1。

表1 供试目的片段扩增及检测引物Table 1 The primers for amplification and detection of target fragments in this study

1.2.2h pa B基因互补菌株的构建及验证 设计互补引物hpa B-CF/CR，使用的模板为Aac5基因组DNA，扩增h pa B基因互补片段，并将其连接于双酶切处理的pBBR1MCS-2质粒中，获得互补载体pBBR-h pa B，将其导入大肠杆菌感受态细胞中。采用三亲杂交的方法，将互补载体导入目的基因缺失突变菌株Δh pa B中，使用引物WFB1/WFB2、h pa B-TF/TR进行PCR验证，并测序验证，获得正确的互补菌株Δh pa Bcomp。连续继代培养，保证互补菌株的遗传稳定性。引物见表1。

1.2.3 致病力测定 采用喷雾接种法[24]，用KB液体培养基于28℃，220r·min-1条件下，振荡培养突变菌株Δhpa B、互补菌株Δh paBcomp以及野生型菌株Aac5至对数期，离心收集菌体，无菌水调节菌悬液浓度至3×108cfu·mL-1。将200mL菌悬液均匀喷雾于健壮的西瓜和甜瓜幼苗叶片（生长至2片真叶期后）的正反两面，无菌水处理作为阴性对照，每种处理各接种3盆西瓜和甜瓜幼苗，无菌白色塑料袋覆盖，置于人工气候培养箱中培养。接种7d后，统计并计算病情指数[25]，试验重复3次。

1.2.4 烟草过敏性反应测定 制备突变菌株Δhpa B、互补菌株Δh pa Bcomp以及野生型菌株Aac5的菌悬液。使用1mL注射器分别将其注射于三生烟草的叶片背面，直至菌悬液注满叶脉间隙，无菌水处理作为阴性对照，每种处理9次重复，24h后观察烟草叶片的变化情况[25]。试验重复3次。

1.2.5 运动能力测定 制备突变菌株ΔhpaB、互补菌株Δhpa Bcomp以及野生型菌株Aac5的菌悬液。每种菌悬液各吸取5μL，在贴近于0.3%半固体培养基表面时，将其一次性全部点在平板上，每种处理9次重复，48h后取出平板，观察供试菌株的运动情况，并拍照记录和测量所形成的晕圈直径大小[25]。试验重复3次。

1.2.6 生物膜形成能力测定 制备突变菌株Δhpa B、互补菌株Δh pa Bcomp以及野生型菌株Aac5的菌悬液。吸取等量菌悬液分别加入24孔聚苯乙烯培养板中，每种处理9次重复，放于28℃培养箱中。3～5d后取出，在80℃固定30min，将菌悬液倒尽，并用无菌水清洗干净，使用0.1%结晶紫染色，45min后将其倒尽，放于37℃培养箱中烘干，并拍照，定性观察培养板中形成生物膜的情况。使用95%乙醇溶液将培养板中形成的生物膜进行溶解，使用分光光度计将供试菌株在OD575条件下的吸光值进行定量测定。通过定性和定量分析来测定供试菌株的生物膜形成能力[25]。试验重复3次。

1.2.7 体内生长能力测定 将制备的突变菌株Δhpa B、互补菌株Δh pa Bcomp以及野生型菌株Aac5菌悬液浓度稀释至106cfu·mL-1和104cfu·mL-1进行试验，使用1 mL注射器将菌液注满于西瓜幼苗（2周龄）子叶的叶片背面，无菌水处理作为阴性对照，每种处理各注射3盆西瓜幼苗。接种后2，24，48，72，96 h后取样，菌悬液浓度为106cfu·mL-1的子叶用于观察叶片发病情况；菌悬液浓度为104cfu·mL-1的子叶用于细菌菌落计数。每种处理各取9片子叶，用打孔器取0.5 cm2，使用MP仪器进行研磨，连续稀释一定浓度梯度后，在KB固体方形培养基上每种处理各取5μL上清液依次点样，28℃培养48h，统计各梯度下细菌菌落数[26]。试验重复3次。

1.2.8 体外生长能力测定 将突变菌株ΔhpaB、互补菌株Δh paBcomp以及野生型菌株Aac5菌悬液稀释100倍后，各取200μL加入100孔聚苯乙烯微量板中，每种处理9次重复，放入自动生长曲线仪，200r·min-1持续振荡培养，测定OD600处的吸光值，每次测定间隔时间为2h，72 h后观察和记录各菌株生长情况[27]。试验重复3次。

1.2.9 qPCR相关基因转录水平测定 采用Trizol法提取野生型菌株Aac5和突变菌株Δhpa B的总RNA，使用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，并统一调节其浓度至100ng·μL-1[24]。用qPCR技术对Ⅲ型分泌系统相关基因（h rc R、h rcQ、hrcV、h rp X、h r pG、hrpE）、毒性相关基因（trbC）、趋化性相关基因（che A）、鞭毛相关基因（f l iC）、菌毛相关基因（pilL）、群体感应相关基因（luxR）以及看家基因rpo B[19]进行检测，分析各基因的表达量采用相对定量法（2-ΔΔCt）[28]。根据荧光定量PCR试剂盒说明书设置反应条件。引物见表2。试验重复3次。

表2 荧光定量PCR引物Table 2 The primers for qPCR

1.2.10 数据处理 使用Excel表格对试验数据进行整理和记录；使用GraphPad Prism 7软件将数据进行作图；所有在相同测定条件下，获得的不同菌株间的试验数据进行差异性分析时，使用SPSS 22.0软件，均采用单因素ANOVA法（置信区间=0.95）；将测定的基因表达量数据进行方差分析和差异显著性比较时，采用独立样本T检验法。

2 结果与分析

2.1 h pa B基因缺失突变菌株的制备及验证

使用WFB1/WFB2引物，能够扩增出360 bp的电泳条带（图1A），验证所获得的菌株为西瓜噬酸菌；用目的基因特异性引物hpaB-TF/TR进行PCR验证，突变菌株Δhpa B无法扩增出该目的片段（图1B），证明成功获得了突变菌株ΔhpaB。

图1 hpa B基因缺失突变菌株电泳图谱（A.WFB1/WFB2检测引物；B.h paB-TF/TR检测引物）Figure 1 Detection the deletion mutant strain of h paB（A.Detection by primers WFB1/WFB2;B.Detection by primers h paB-TF/TR）

2.2 h pa B基因互补菌株的制备及验证

使用WFB1/WFB2引物，能够扩增出360 bp的电泳条带（图2A），验证所获得的为西瓜噬酸菌；目的基因特异性引物h paB-TF/TR进行PCR验证，能够扩增出相应的片段大小为271 bp的电泳条带（图2B），经PCR和测序结果验证，证明成功获得了互补菌株ΔhpaBcomp。

图2 h paB基因互补菌株电泳图谱（A.WFB1/WFB2检测引物；B.hpa B-TF/TR检测引物）Figure 2 Detection of the complementary strain of h paB（A.Detection by primers WFB1/WFB2;B.Detection by primers hpa B-TF/TR）

2.3 致病力测定结果

接种7d后，接种突变菌株Δh paB菌液的植株幼苗，叶片上的发病程度较轻；接种野生型菌株Aac5菌液的植株幼苗，已经发生部分叶片坏死的症状，并在叶片上出现了不同程度的病斑；接种互补菌株ΔhpaBcomp菌液的植株幼苗，同样在叶片上出现明显的发病症状。结果表明，突变菌株Δh pa B对寄主植物西瓜和甜瓜的致病力显著减弱，互补菌株Δh pa Bcomp能够基本恢复致病力（图3A和图3B）。

病情指数结果显示：在接种西瓜和甜瓜幼苗时，突变菌株ΔhpaB病情指数显著低于野生型菌株Aac5的病情指数互补菌株能够基本恢复致病力(图3C和图3D)。表明h pa B基因缺失后，显著降低了西瓜噬酸菌在西瓜和甜瓜幼苗上的致病力。

图3 供试菌株的致病力Figure 3 The pathogenicity of test strains

2.4 烟草过敏性反应测定结果

注射野生型菌株Aac5和互补菌株Δh paBcomp菌液的烟草均能够引起过敏性反应，而注射突变菌株Δh pa B菌液的烟草均不能引起过敏性反应（图4）。结果表明h paB基因缺失后，使得西瓜噬酸菌丧失了诱导非寄主烟草HR应答能力。

图4 供试菌株的烟草过敏性反应Figure 4 The hypersensitive reaction on the leaf of Ni cotiana tab acum of test strains

2.5 运动能力测定结果

由图5可知，突变菌株Δh pa B形成的晕圈直径与野生型菌株Aac5相比有所缩小，说明h pa B基因缺失后使其运动能力减弱，互补菌株ΔhpaBcomp基本能够恢复其运动能力。表明h pa B基因缺失后，西瓜噬酸菌的运动能力下降。

图5 供试菌株的运动能力（A.供试菌株的运动情况；B.菌落晕圈直径）Figure 5 The swimming ability of test strains（A.The swimming ability of test strains;B.The colony diameter）

2.6 生物膜形成能力测定结果

与野生型菌株Aac5相比，突变菌株ΔhpaB形成的生物膜更明显，互补菌株Δh paBcomp形成的生物膜与野生型相近（图6A），测定突变菌株Δh paB在OD575下的吸光值也显著提高，互补菌株能够基本恢复生物膜的形成能力（图6B）。表明hpaB基因缺失后，西瓜噬酸菌生物膜的形成能力增强。

图6 供试菌株生物膜形成能力（A.供试菌株在培养板中形成的生物膜；B.供试菌株在OD575的吸光值）Figure 6 The biofilm formation ability of test strains（A.The biofilm formation of test strains in culture plates;B.The absorbance of test strains at OD575）

2.7 体内生长能力测定结果

注射野生型菌株Aac5和互补菌株Δh paBcomp菌液后48h，子叶上均已经有萎蔫褪绿的现象，并且野生型菌株Aac5开始出现皱缩现象；72h时，这两种处理的子叶均出现明显的皱缩现象；96h时，这两种处理的子叶已经发生大面积坏死症状。而在注射突变菌株Δhpa B菌液，在96h观察时间内，子叶均无明显发病症状（图7A）。注射低浓度104cfu·mL-1菌液观察子叶内的菌落数量变化，发现注射野生型菌株Aac5及互补菌株Δhpa Bcomp菌液后，随时间增加，子叶内的菌落数量均呈指数递增；而注射突变菌株Δhpa B菌液后，子叶内的菌落数量增长速率均较野生型和互补菌株缓慢（图7B）。表明h pa B基因缺失后，西瓜噬酸菌在寄主体内的生长能力下降。

图7 供试菌株的体内生长能力测定（A.发病子叶；B.子叶中菌落数量的变化）Figure 7 The i n vivo growth ability of test strains（A.Comparison of the incidence of cotyledons;B.The changes of bacteria content in cotyledons）

2.8 体外生长能力测定结果

8～40 h供试菌株生长速率均呈指数增长，随后生长速率趋于平缓，与野生型菌株Aac5相比，突变菌株Δh paB生长能力显著下降，较晚到达对数期，互补菌株Δhpa Bcomp能够基本恢复生长能力（图8）。表明h pa B基因缺失后，西瓜噬酸菌在寄主体外的生长能力下降。

图8 供试菌株的体外生长能力测定Figure 8 The in vitro growth ability of test strains

2.9 h pa B基因缺失影响T3SS及致病相关基因的转录水平

与野生型菌株Aac5相比，突变菌株ΔhpaB中hpa A、h rp E和hrcR基因表达极显著上调，h rp X和hrpG基因表达显著上调，hrcQ基因表达显著下调，hrcV基因表达无显著变化（图9A），说明基因h pa A、hrpE、h rcR、hrpX和hrpG与h paB负相关，基因hrcQ与hpaB呈正相关。

与野生型菌株Aac5相比，突变菌株ΔhpaB中毒力蛋白基因trbC表达极显著上调，鞭毛基因f l iC表达显著上调，群体感应相关基因l uxR显著下调，菌毛基因pilL表达和趋化性基因ch eA无显著变化（图9B），说明基因trbC和fliC与h paB呈负相关，基因luxR与hpaB呈正相关。结果表明h pa B基因与T3SS及致病相关基因之间存在一定的调控关系。

图9 突变菌株Δh paB中相关基因转录水平（A.T3SS相关基因表达量；B.其他致病相关基因表达量）Figure 9 Transcription of the related genes inΔhpaB（A.Relative expression levels of gene associated with the typeⅢsecretion system;B.Gene transcription levels relative to other pathogenic genes）

3 讨论与结论

许多病原菌与寄主相互作用的关键是III型分泌系统，该系统存在于大多数革兰氏阴性细菌中[29]。Ⅲ型分泌系统已经在许多模式生物中进行了深入研究，包括致病性大肠杆菌（Escheri ch ia coli）、耶尔森菌（Yersi ni a）、志贺氏菌（S hi gella）、沙门氏菌（S almonella）等动物病原菌以及欧文氏菌（Erwinia）、伯克氏菌（Burkh old eria）、青枯菌（Ralst oni a sol anacearum）、黄单胞菌属（Xant homonasspp.）和丁香假单胞菌（Pseud omonas syringae）等植物病原细菌[29]。

西瓜噬酸菌在侵染寄主的过程中有多种复杂的致病机制，其中T3SS致病机制与其致病力密切相关[30]。目前，有研究表明，基因h r p G以及hrpX可能是其Ⅲ型分泌系统的核心调控因子，诱导烟草发生过敏性反应及活性氧爆发，参与调控生物膜的形成，对于西瓜噬酸菌的致病能力具有重大贡献[19]。Ⅲ型分泌系统保守基因hrcN与结构基因hrcQ对西瓜噬酸菌的致病力、过敏性、运动能力等均有影响[31-32]。

本试验构建了西瓜噬酸菌突变菌株Δhpa B和互补菌株ΔhpaBcomp，并对致病力及其他致病相关表型进行测定。结果表明：与野生型菌株Aac5相比，突变菌株ΔhpaB显著降低了对寄主植物西瓜和甜瓜的致病能力，其生长能力测定结果发现，无论在寄主体内或者体外均明显下降，说明hpa B是西瓜噬酸菌的一个关键的致病基因。运动能力和生物膜形成能力会影响致病菌的致病能力[26]，该基因缺失后，提高了生物膜形成能力，运动能力减弱。而且丧失了引起非寄主烟草发生过敏性反应，说明hpaB是西瓜噬酸菌诱导非寄主烟草HR应答能力的关键基因之一，该实验结果与野油菜黄单胞菌中h paB基因缺失后结果一致[33]。互补菌株Δhpa Bcomp在测定过程中基本均能够恢复这些能力。

本试验同时测定了T3SS及致病相关基因的表达量，Ⅲ型分泌系统致病机制与其致病力密切相关[34]，h paA基因编码的蛋白质可能为Ⅲ型分泌系统分泌调节蛋白；基因h r p G以及hrpX可能是其Ⅲ型分泌系统的核心调控因子[19]；hrcR和hrcV基因编码的蛋白定位于细菌内膜，是分泌通道主要成分之一[35-36]；hrpE基因编码的蛋白与Ⅲ型分泌系统Hrp pilus形成有关[37]；hrc Q基因编码的蛋白是Ⅲ型分泌系统的装置蛋白[32]。鞭毛及趋化性对于细菌的运动能力十分重要[24]，群体感应系统对于西瓜噬酸菌的毒力、运动能力和生物膜形成能力等均有调控作用[38]，Ⅳ菌毛有利于细菌的运动、定殖和侵染[26]。毒性蛋白则是细菌发挥毒力作用的重要媒介[31]。因此，本试验选取上述与致病性相关的基因，推测hpa B基因可能通过与以上基因相互作用从而在西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统致病过程中发挥着重要的作用，同时毒力蛋白基因trbC表达量显著上升，进一步验证了h paB与西瓜噬酸菌致病性的重要关系。并且h pa B基因可能通过影响鞭毛基因fliC和群体感应基因luxR基因的表达，进而对运动能力和生物膜形成能力等致病相关表型产生影响。

综上可知，hpaB是西瓜噬酸菌致病过程中重要的调控因子，本研究初步探索了h pa B基因在西瓜噬酸菌中的功能，有助于进一步研究HpaB蛋白在Ⅲ型分泌系统中发挥的功能，从而为更好地防治瓜类细菌性果斑病提供理论依据。