不同氮效率紫花苜蓿各生育期氮利用特征研究

王 静， 刘晓静， 郝 凤， 汪 雪

(甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 甘肃省草业工程实验室， 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心， 甘肃 兰州 730070)

氮效率指的是植物对氮素的固定、吸收和转化能力的综合体现[1]。同种作物的不同品种对氮素的吸收和利用不同，从而导致品种间存在氮效率差异[2]。因此，充分挖掘作物自身的氮高效潜力是协调作物增产和环保的有效途径[3]。目前，已有大量关于作物氮效率差异的研究报道。王建强等[4]的研究表明，氮高效型油菜(Brassicacampestris)比氮低效型对低氮胁迫的耐受力更强，对养分的吸收累积能力也相对较强。王春晓等[5]在花生(Arachishypogaea)对氮素吸收利用的研究中发现，氮高效品种的氮肥利用率和氮肥偏生产力分别比氮低效品种高5.4%和11.6%。前人通过大量研究证实氮效率差异主要表现在作物的物质生产与积累特性[6]、根系特性[7-8]以及氮代谢酶活性[9-10]等方面，而且氮高效型作物种质会表现出较好的农艺性状和氮代谢特征，可见，较强的氮素吸收能力和较好的植株生长特性是作物在低氮胁迫环境下获得氮高效的生物学基础。不同品种间氮效率差异是普遍存在的现象，但作物生育期某一阶段的氮素利用特征只能说明其具有氮高效潜力。为了明确作物在不同生育期的氮素利用特征，研究者们也对作物不同生长阶段的氮效率进行了研究，不同基因型作物在各生育期也存在明显的氮效率差异[11-13]。关于作物不同生育期氮效率差异的研究主要集中在禾本科作物上，对豆科作物此方面的研究较少，因此，开展这方面的研究非常有必要。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培面积最大的多年生优质豆科牧草，是畜牧业生产中不可或缺的优质植物性蛋白饲料。与禾本科相比，豆科紫花苜蓿的氮效率规律更具复杂性，其对氮素的吸收利用更为复杂，除能从土壤中获取外源氮外，其根系也可被根瘤菌侵染形成根瘤，进而转化空气中游离的氮供自身生长发育。研究发现，不同紫花苜蓿品种的氮素吸收利用能力存在差异，因而其对氮素的响应不同，氮肥报酬率在品种间差异极显著[14]，从而导致干物质与氮积累存在差异[15]。目前，针对紫花苜蓿氮效率差异已开展研究，且已明确不同氮效率紫花苜蓿的氮素吸收特性、氮素固定特性及氮素转化能力存在明显的差异，但该研究只集中在紫花苜蓿生育期的某一阶段，尚未涉及到紫花苜蓿氮效率差异在不同生长阶段的特征规律。

本研究以不同氮效率类型的紫花苜蓿为对象，对不同生育期紫花苜蓿的氮效率差异展开研究，以期探明不同氮效率类型紫花苜蓿在不同生育期的氮营养特征，为进一步研究紫花苜蓿氮高效机理和实现紫花苜蓿生产中的氮养分高效管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

依据本团队前期对紫花苜蓿氮效率的研究成果，选取4个不同氮效率紫花苜蓿品种，“LW6010”(氮高效型)，“甘农3号”(氮常效型)，“甘农7号”(氮反效型)和“陇东苜蓿”(氮低效型)；紫花苜蓿品种均由甘肃农业大学草业学院提供。

供试菌株为中华根瘤菌(12531)，由甘肃农业大学草业学院提供。

1.2 试验设计

1.2.1试验地概况 试验地位于甘肃农业大学，地理位置为北纬36°03′，东经103°40′，海拔1 525 m，属中温带大陆性气候，日照多，气候干燥，昼夜温差大，年均温10.3℃，土壤含水量为13.88%，年均蒸发量1 410 mm，年日照数平均2 600 h，无霜期180 d以上。

1.3 测定指标及方法

1.3.1取样时期 苗期(5月25日)：有80%的植株开始分枝时；

现蕾期(6月15日)：有15%以上的植株在叶腋间已形成花蕾；

盛花期(7月1日)：有75%左右的分枝开始开花；

结荚期(7月12日)：有10%以上的分枝花序已结荚；

成熟期(7月25日)：有80%以上的果实成熟。

1.3.2指标测定 株高：各处理随机选取10株，用直尺测量植株绝对高度，每个处理重复3次;

生物量：将植株冲洗干净后，用滤纸吸去多余水分，每个处理随机选取10株将地上部分和地下部分分离进行生物量称重，每个处理重复3次。之后将鲜样进行105℃杀青15 min，在75℃烘干称其干重;

根系总长度、根体积和根表面积指标通过EPSON Experssion扫描仪和WinRHIZO根系分析系统软件进行测定;

根瘤数：将植株冲洗干净后，每个处理随机选取5株统计所有根瘤数量，计算单株根瘤总数，每个处理重复3次;

根瘤重：将植株冲洗干净后，每个处理随机选取5株统计所有根瘤数量后用分析天平进行称重，计算单株根瘤总鲜重，每个处理重复3次;

固氮酶活性：采用乙炔还原法用气象色谱进行测定[16-17];

硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)：参考邹琦的方法进行测定[18];

氮素利用效率：采用凯氏定氮法测定含氮量[19]。按以下公式进行相关指标计算：

地上氮积累量=地上含氮量×地上干重；地下氮积累量=地下含氮量×地下干重

氮素利用效率=植株干重/整株氮积累量[20]

1.4 数据分析

采用Excel 2016进行数据整理和图表绘制，SPSS25.0进行显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿各生育期株高和生物量

4种不同氮效率紫花苜蓿的株高和地上生物量随生育期的推进呈上升趋势，在成熟期达到最大。高氮处理下，“LW6010”和“甘农3号”的株高和地上生物量在各生育期均显著高于“甘农7号”和“陇东苜蓿”，其地下生物量在结荚期和成熟期显著高于“甘农7号”和“陇东苜蓿”(P<0.05)；低氮处理下，“LW6010”和“甘农7号”的株高在各生育期显著高于“甘农3号”和“陇东苜蓿”，其生物量在结荚期和成熟期显著高于“甘农3号”和“陇东苜蓿”(P<0.05)。随着施氮量的增加，4种不同氮效率紫花苜蓿品种各生育期的株高和生物量显著增加(P<0.05) (图1,表1)。

图1 不同氮效率紫花苜蓿的株高Fig.1 Effects of nitrogen levels on plant height in different nitrogen efficiency varieties注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别代表苗期、现蕾期、盛花期、结荚期、成熟期；图中不同小写字母表示同生育期同一处理下不同品种间差异显著，不同大写字母表示同生育期同一品种不同氮处理下差异显著(P<0.05)。下同Note:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ means of the seeding stage,the budding stage,the flowering stage,the seed podding stage and the maturing stage. Different lowercase letters indicate significant differences between different varieties under the same growth period and the same treatment,and different capital letters indicate significant differences under the same growth period and the same variety under different treatments(P<0.05).The same as below

表1 不同氮效率紫花苜蓿的地上生物量Table 1 Effects of nitrogen levels on above-ground biomass in different nitrogen efficiency varieties 单位：g

2.2 紫花苜蓿各生育期总根长、根表面积和根体积

如表2所示，4种不同氮效率紫花苜蓿的总根长、根表面积和根体积均随生育期的推进逐渐增加，均在成熟期达到峰值。在高氮和低氮处理下，4种紫花苜蓿的根系特性均表现为：“LW6010”的总根长和根体积显著高于“陇东苜蓿”(P<0.05)，而“甘农3号”和“甘农7号”介于二者之间，且在不同氮水平下表现相反。4种紫花苜蓿品种的根系特性在不同氮水平下表现为：苗期至现蕾期总根长和根体积在低氮处理时显著高于高氮处理，盛花期至成熟期根体积在高氮处理时显著高于低氮处理(P<0.05)。

表2 不同氮效率紫花苜蓿的总根长、根表面积和根体积Table 2 Effects of nitrogen levels on total root length,root dry weight,root surface area and root volume in different nitrogen efficiency varieties

续表2

2.3 紫花苜蓿各生育期根瘤数、根瘤重和固氮酶活性

4种不同氮效率紫花苜蓿的根瘤数和根瘤重随生育期的推进呈先上升后下降的趋势，在结荚期达到最大。高氮处理下，“LW6010”的根瘤数在现蕾期显著高于“甘农7号”和“陇东苜蓿”，其根瘤重在苗期、现蕾期和盛花期显著高于“甘农7号”和“陇东苜蓿”(P<0.05)；低氮处理下，根瘤数表现为“LW6010”和“甘农7号”在现蕾期和结荚期显著高于“陇东苜蓿”，其根瘤重则在盛花期和结荚期显著高于“陇东苜蓿”(P<0.05)。“甘农3号”的根瘤数和根瘤重在高氮处理时显著高于低氮处理(P<0.05)。(图2，图3)

图2 不同氮效率紫花苜蓿的根瘤数Fig.2 Effects of nitrogen levels on number of nodules in different nitrogen efficiency varieties

图3 不同氮效率紫花苜蓿的根瘤重Fig.3 Effects of nitrogen levels on nodule weight in different nitrogen efficiency varieties

固氮酶活性在不同生育期的变化同根瘤数和根瘤重一致。高氮处理下，“LW6010”和“甘农3号”的固氮酶活性在成熟期显著高于“陇东苜蓿”(P<0.05)；低氮处理下，“LW6010”和“甘农7号”的固氮酶活性在盛花期和成熟期显著高于“陇东苜蓿”(P<0.05)。从盛花期至成熟期，“甘农7号”的固氮酶活性在不同氮水平下表现为低氮处理显著高于高氮处理(P<0.05) (表3)。

表3 不同氮效率紫花苜蓿的固氮酶活性Table 3 Effects of nitrogen levels on nitrogenase activity in different nitrogen efficiency varieties 单位：μmol·g-1

2.4 紫花苜蓿各生育期氮代谢关键酶活性

如表4所示，4种不同氮效率紫花苜蓿的GS和NR活性随生育期的推进呈先上升后下降的趋势，在盛花期达到最大。高氮处理下，“LW6010”和“甘农3号”的NR活性在各生育期均显著高于“甘农7号”和“陇东苜蓿”，其GS活性在苗期和现蕾期显著高于“甘农7号”和“陇东苜蓿”(P<0.05)；低氮处理下，“LW6010”和“甘农7号”的NR活性除盛花期外均显著高于“甘农3号”和“陇东苜蓿”，GS活性在苗期、盛花期和成熟期显著高于“甘农3号”和“陇东苜蓿”(P<0.05)。随着氮水平的提升，4种不同氮效率紫花苜蓿品种各生育期的GS和NR活性均有所提高，且“甘农3号”的NR、GS活性在高氮处理显著高于低氮处理(P<0.05)。

表4 不同氮效率紫花苜蓿的氮代谢酶活性Table 4 Effects of nitrogen levels on nitrogen metabolizing enzyme activity in different nitrogen efficiency varieties 单位：μmol·g-1·h-1

2.5 紫花苜蓿各生育期地上、地下氮积累量和氮素利用效率

4种不同氮效率紫花苜蓿的氮积累量随生育期的推进逐渐增加；高氮水平下氮素利用率均随生育期的推进逐渐增加，在成熟期达到最大，而低氮水平下氮素利用率整体表现为随生育期推进呈先减小后增加的趋势，在苗期最大、现蕾期最小。高氮处理下，“LW6010”和“甘农3号”的地上氮积累量除现蕾期外均显著高于“陇东苜蓿”，其氮素利用率除成熟期外均显著高于“陇东苜蓿”(P<0.05)；低氮处理下，“LW6010”和“甘农7号”的地上、地下氮积累量在结荚期和成熟期显著高于“陇东苜蓿”，其氮素利用率在苗期和成熟期显著高于“陇东苜蓿”(P<0.05)。全生育期内，4种紫花苜蓿的地上氮积累量在高氮水平下显著高于低氮水平，而氮素利用率除成熟期外在低氮处理显著高于高氮处理(P<0.05) (表5)。

表5 不同氮效率紫花苜蓿的地上、地下氮积累量和氮素利用率Table 5 Effects of nitrogen levels on aboveground and underground nitrogen accumulation and nitrogen utilization in different nitrogen efficiency varieties

2.6 氮效率影响因子的逐步回归分析

物质积累量与氮素含量之间存在线性关系，可以通过施氮促进植株生长，反之，也可以通过其生物量来判断不同品种的氮效率[21]。紫花苜蓿是以收获营养体为目标，因此用地上生物量作为因变量，地下生物量、总根长、根体积、根表面积、根瘤数、根瘤重、固氮酶活性、NR及GS为自变量进行逐步回归分析，结果显示地下生物量、NR、固氮酶活性、根瘤重及总根长进入回归方程，回归方程为：地上生物量=0.038+1.531×地下生物量+0.005×NR-0.003×固氮酶活性+38.564×根瘤重-0.001×总根长，地下生物量、总根长、根体积、根表面积、根瘤数、根瘤重、固氮酶活性、NR及GS解释了98.2%的氮效率差异(表6)。

表6 氮效率影响因子的逐步回归Table 6 Stepwise regression of factors affecting nitrogen efficiency

3 讨论

不同氮水平下紫花苜蓿结瘤固氮能力随生育期的推进均呈先上升后下降的趋势，苗期是根瘤初步形成阶段，其数量较少且固氮酶活性也较低，当植株生长进入旺盛的营养生长阶段后，根瘤迅速发育，直至结荚期根瘤数、根瘤重和固氮酶活性均呈直线上升，到结荚期达到最大值，表明紫花苜蓿的结瘤固氮能力在结荚期最强，这与索炎炎[22]等和吴正锋[23]等的研究结果一致。植株根系总根长、根表面积、根体积等是反映根系构型形态的主要参数，本研究表明2个氮水平下紫花苜蓿根系特性变化在全生育期呈单峰上升趋势，成熟期达到最大，在苗期至结荚期根系快速生长，结荚期至成熟期增长缓慢，这是因为苗期至结荚期紫花苜蓿主要是营养生长阶段，而发达的根系是其营养生长的重要基础，此时光合作用所产生的大部分碳水化合物用于其进行以根系和叶片为中心的营养生长，而结荚期之后紫花苜蓿主要进行生殖生长，生长中心转变为结实器官，营养元素主要向籽粒中转移[24]。在植物的整个氮代谢过程中离不开氮代谢酶的参与，尤其是NR和GS对植物的生长发育起至关重要的作用，随着生育期的推进，各氮水平下氮代谢酶活性均随着生育期的推进呈先上升后下降的趋势，在盛花期达到峰值，说明紫花苜蓿在生育前期氮代谢酶活性高，对氨的同化能力也较强，盛花期之后NR、GS活性逐渐降低，可能是由于随着生育期的推进紫花苜蓿各器官慢慢衰老，导致氮代谢酶活性下降。张智猛等[25]对花生的研究也有类似发现。

4 结论

4个紫花苜蓿品种对氮素的固定、吸收及转化随着生育期的推进表现不同，结瘤特性在结荚期最突出，根系在成熟期发育最好，氮代谢相关酶活性在盛花期最高，成熟期氮素积累最多、利用率最高。不同氮效率类型的紫花苜蓿确存在品种间差异，氮高效型紫花苜蓿“LW6010”在各生育期的结瘤特性、根系特性、生长特性、氮代谢酶活性及氮积累高于“陇东苜蓿”，即氮高效紫花苜蓿品种“LW6010”对氮素的固定、吸收及转化能力优于氮低效型品种“陇东苜蓿”，而氮常效型品种“甘农3号”和氮反效型品种“甘农7号”则介于前二者之间。