体外产气法评价全株藜麦与全株玉米混合青贮饲料饲用价值

路平乐， 魏玉明， 杨发荣， 江小帆， 李 倩， 赵生国， 蔡 原*， 焦 婷

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院， 甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所， 甘肃 兰州 730070； 3.甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心， 甘肃 兰州 730070)

藜麦(Chenopodiumquinoa)，苋科(Amaranthaceae)藜亚科藜属(ChenopodiumL.)作物，原产于南美洲，在安第斯山地区有着7 000年的种植历史，是古印第安人的主要粮食作物之一[1]。藜麦因营养价值高而全，适应性强等特点，不仅成为了世界各国人们青睐的食用口粮，也因其籽实、麸皮、秸秆等含有较高蛋白质，而被广泛应用于饲料制作中[2]。藜麦秸秆被用作饲草料时，其所含有的木质素含量低于玉米秸秆，拥有更好的适口性和更高的动物消化吸收率[3]，因此藜麦作为一种优质饲草被开发利用。此外，藜麦中同时含有少量皂苷、单宁、非淀粉多糖以及植酸等抗营养因子，这些成分会影响胰蛋白酶和糜蛋白酶等消化酶的功能[4]。为了最大限度地提高藜麦的营养品质，可通过青贮的方法对这些抗营养因子进行有效的控制。青贮是一种被广泛应用的谷物和牧草的保鲜方法，可最大限度地保留牧草的营养价值，并且有较好的适口性[5]。目前，青贮技术发展较为成熟，因其具有原料丰富，青贮方式多样[6]，添加剂种类繁多等特点，在近年开始被广泛研究[7]。

我国草地资源丰富，天然草地面积广阔[8]。自21世纪以来，由于自然灾害频发、饲草资源储备能力不足以及优良牧草品种较少等原因，使得我国的粗饲料短缺，无法获得更多的饲草料供给国内的畜牧业发展[9]。因此，实现饲料的工业化生产和开发新的饲料资源是我国目前面临的必要措施[10]。目前国内外对有关于藜麦青贮饲料、其副产物开发利用及在日粮中的添加比例等方面的研究鲜有报道[11]。本试验通过将全株藜麦与全株玉米按不同比例混合青贮，对比全株藜麦与全株玉米不同比例混合青贮下的青贮品质及发酵特性的异同。同时，利用体外产气法[12]对各青贮组进行模拟发酵，并进行相应指标测定，以期找到利于反刍动物消化吸收的全株藜麦与全株玉米的最佳混合青贮比例，为藜麦饲料化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1样品材料 试验所用的全株藜麦(‘台湾红藜’)及全株玉米(‘金凯3号’)均于2020年10月12日在甘肃省广河县农业科技试验示范基地机械刈割，此后立即按照不同试验设计比例混合后进行桶装青贮，青贮60 d，开桶将饲料混合均匀后使用四分法采取样品。

1.2 试验设计

试验采用单因素试验设计，青贮料采用桶装青贮方式青贮，桶的体积为15 L。将全株藜麦与全株玉米分别以不同比例(以鲜重为基础)混合青贮，具体混合比例及分组命名见表1。青贮60 d后开桶取样，并进行感官品质检测。选择颜色呈黄绿色、气味带有微弱芳香味、质地松散无霉变的优质青贮料带回甘肃农业大学动物营养实验室，将样品于 65℃烘箱中烘干恒重后，粉碎，自封袋中密封保存备用，用于各指标的测定。

表1 全株藜麦与全株玉米混合比例(以鲜重为基础)Table 1 Grouping and proportion of silage of whole quinoa and corn in different proportions(Based on fresh weight) 单位：%

1.3 试验方法

1.3.1常规营养成份测定 常规营养成份分析参考贺建华主编的《饲料原料分析与检测》一书进行，干物质测定采用直接烘干法；粗蛋白用全自动凯氏定氮仪测定；粗脂肪用全自动脂肪分析仪测定；粗灰分采用马福炉灼烧法测定；中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维用Van Soest纤维分析法测定。

1.3.2瘤胃液采集及培养液配制 试验所用瘤胃液是在体外发酵试验当天清晨在屠宰场屠宰羊只瘤胃中获得，将其通过4层纱布过滤入预热过的暖壶中，期间不断通入CO2，待用培养液参考Menke等[13]方法制备。

1.3.3体外发酵及产气量测定

1.3.3.1 体外发酵

准确称取经烘干处理过的不同混合比例的全株藜麦-玉米青贮饲料(0.2000±0.0010 g)，装入孔径为50 um、长宽为2.0 cm×3.0 cm的尼龙袋中，用尼龙绳绑紧封口，每组三个重复，并设置空白对照组(尼龙袋中不加发酵底物)，将其放置于体外产气管(100 mL)的底部。同时加入预先配制好的人工瘤胃液30 mL(瘤胃液10 mL+缓冲液20 mL)，排出其中多余气体后立即将产气管前端橡皮套密封，并记录此时产气管刻度值(mL)，放置于39℃恒温水浴锅支架上。此后在第2 h，4 h，6 h，9 h，12 h，24 h，36 h和第48 h时记录产气管刻度值(mL)，每次读数后轻轻摇晃产气管以模拟动物瘤胃活动。

1.3.3.2 产气值测定

GPt=200×(Vt-Vo)/W

上式中，GPt(Gas Production，mL)为各组合在t时刻的产气管读数(mL)；V0为体外发酵反应时该产气管在0 h的读数(mL)；Vt为体外发酵反应时该产气管在t h时的读数(mL)；W为该产气管内样品的干物质重(mg)。

某时刻GP(mL)= 该时刻样品GP-该时刻空白管GP

1.3.4发酵产物及残渣采集 体外发酵48 h后，记录此时的产气管产气值GP48，将发酵液收入离心管中，将产气管中的尼龙袋取出放入冰水中浸泡，使尼龙袋中样品发酵终止。随后将尼龙袋放入蒸馏水中反复清洗，洗至蒸馏水澄清且颜色无变化时取出沥干，放入65℃烘箱中烘干并恒重，并测定体外干物质降解率(IVDMD)。发酵液经3 000 r·min-1离心10 min后取上清液分装于5 mL离心管中，并于-20℃保存备用，后期用于测定乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)及丁酸(Butyric acid,BA)等挥发性脂肪酸浓度及氨态氮(NH3-N)含量。

1.3.5指标测定 使用P 611型酸度计测定仪测定pH；使用苯酚-次氯酸钠比色法[14]测定氨态氮(NH3-N)，并计算出氨态氮总量；使用气相色谱法测定[15]挥发性脂肪酸(VFA)浓度(气相色谱仪型号为安捷伦-8890)；

体外干物质降解率计算 体外干物质降解率(In vitro dry matter digestibility，IVDMD)=(消化前样品重量×消化前DM含量-残渣样品重量×残渣DM含量)/(消化前样品重量×消化前DM含量)×100%；

采空区充填后形成含水介质为中粗砂的含水层，围岩具有隔水作用。地下水的主要补给来源为大气降水，渗入地下部分沿基岩构造裂隙发育方向，汇集到中粗砂中，其排泄方式主要为人工开采。经估算，采空区蓄置的含水层，调节资源量约为1.3万m3，单井涌水量大于1000m3/d，成为花岗岩基岩裂隙水贫水区中的富水地段。

产气参数计算利用“fit curve”软件(MLP；Lawes Agricultural Trust)，根据Фrskov[16]和McDonald(1979)的产气模型公式将各样品在2 h，4 h，6 h，9 h，12 h，24 h，36 h及48 h的GP代入，计算消化动力参数，消化动力模型公式为∶

GP=a+b(1-exp-ct)

式中，t为发酵开始后的某一时间(h)；a为快速产气部分；b为缓慢产气部分；c为产气速度常数；a+b为潜在产气量。

1.4 灰色关联度分析

根据灰色系统理论，将每组全株藜麦与全株玉米不同比例混合的青贮料作为灰色系统的一个因素,应用灰色关联度分析法对全株藜麦与全株玉米不同比例混合的青贮料的营养品质和发酵特性(GP以GP24为准)进行综合分析[17]。

首先，确定参考数列。以各测定指标的最理想值构成参考数列∶X0(k) = {X0(1)，X0(2)，X0(3)，…，X0(n)}，各指标的测定值为比较数列∶Xi(k) ={Xi(1)，Xi(2)，Xi(3)，…，Xi(n)}，其中k= 1，2，3，…，n(n为测定指标数，此处为 17)，i= 1，2，3，…，m(m为全株藜麦与玉米不同比例混合组数，此处为 11)。其次指标的无量纲化。用Xi' (k) =Xi(k)/X0(k) 对各指标原始数据进行无量纲化处理。然后计算比较数列Xi与参考数列X0各对应点的绝对差值。△i(k) = |X0(k)-Xi(k)|，此处△i(k) 为第i全株藜麦与玉米不同比比例混合组的指标测定值Xi与理想值X0在第k个指标上的绝对差值，则理想数列X0和比较数列Xi在k点的关联系数εi(k)∶

式中∶minmin|X0(k)-Xi(k)|为二级最小差；maxmax|X0(k)-Xi(k)|为二级最大差；ρ为分辨系数，本研究中取为0.5，视为同等重要[18]。

最后，计算等权关联度、加权关联度。

求出关联度后，按照关联度由大到小进行排序，关联度越大，则说明比较数列越接近参考数列，综合青贮效果越优。

1.5 数据处理及统计分析

采用Excel进行前期数据处理和制图，采用SPSS 22. 0软件的One-way ANOVA进行单因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较，结果以平均值和均值标准误(Mean ± SEM)表示，以P<0.05为差异显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 营养价值

由表2可知，随着全株藜麦含量的降低，各处理组混合青贮饲料的DM含量呈现先下降后逐渐升高的趋势，蛋白含量及粗灰分含量逐渐降低。当为100%玉米时，其DM含量显著高于其他处理(P<0.05)；CQC01组的粗蛋白及粗灰分含量显著低于CK组(P<0.05)；CQC91组的粗脂肪含量高于CK组，且差异不显著；CQC01组的中性洗涤纤维含量较CK组偏高，差异不显著；CQC01组的酸性洗涤纤维含量显著低于CK组(P<0.05)。

表2 青贮饲料组成及常规营养成分表(风干基础)Table 2 Feed composition and routine nutrients(Air dry base)

2.2 体外产气量

由图1可知，在产气0～2 h时，各组间累计产气量基本一致；在产气进行到2～6 h时，各组间的产气量差异开始逐渐增大且CQC01组的产气量高于CK组；发酵24 h时，各组体外发酵能力增强，速度开始达到最大；在第36 h时，各组体外发酵能力开始减弱，甚至趋向于停止，且此时可看出，CQC64、CQC28、CQC46组的产气量从产气第4 h开始逐渐高于其他各组，在第36 h差异达到最大，表明这3组的产气效果尤为良好。

图1 0 h～48 h各组饲料产气量变化趋势图Fig.1 Change trend of feed gas production in each group from 0 h～48 h

2.3 单一青贮饲料体外产气参数

由表3可知，CK组和CQC01组快速产气部分a值分别为4.81和1.42，说明全株藜麦和玉米都不存在产气滞后效应，且在快速产气部分时间(a)全株藜麦长于玉米；缓慢产气部分时间b值分别为21.87和39.59，且玉米的缓慢产气时间长于全株藜麦。在24 h时，玉米和全株藜麦的产气量分别为21.67和33.50，且玉米的产气量高于全株藜麦。玉米的干物质降解率高于全株藜麦。

2.4 混合青贮饲料体外产气参数

由表4可知，CQC19组和CQC37组的快速产气部分显著高于其他各组(P<0.05)，CQC46组存在产气滞后效应；CQC28组的缓慢产气部分和潜在产气部分显著高于较其他组(P<0.05)；CQC46组和CQC28组的24 h时产气量GP24h最高，高于其他组4.33 mL，显著高于其他各组(P<0.05)。CQC64组的干物质消失率(IVDMD)显著高于其他组(P<0.05)。

2.5 全株藜麦与全株玉米不同比例混合青贮饲料组合后的IVDMD变化

由表3及表4可知，在体外发酵结束后，各组的IVDMD都低于 60 %，全株藜麦的IVDMD低于全株玉米，且CQC64组体外IVDMD值(0.51)显著高于其他各混合青贮饲料组(P<0.05)，同时高于单一青贮饲料CK(藜麦)组和CQC01(玉米)组。

表3 单一青贮饲料体外产气参数Table 3 In vitro gas production parameters of single silage

表4 全株藜麦与全株玉米不同比例混合青贮饲料产气参数Table 4 Gas production parameters of silage mixed with whole quinoa and corn in different proportions

2.6 全株藜麦与全株玉米不同比例混合青贮饲料组合后的瘤胃发酵特性变化

由表5可以看出，本试验中CQC91，CQC19和CQC01组的总挥发性脂肪酸含量显著高于其他各组(P<0.05)；CQC64，CQC19，CQC91组的乙酸含量显著高于其他各组(P<0.05)；CQC01组的丙酸含量显著高于其他各组(P<0.05)，CQC55组的含量显著低于其他各组(P<0.05)；异丁酸和戊酸含量在各组中差异不显著；CQC01，CQC46组的丁酸含量显著高于其他各组(P<0.05)；异戊酸含量在CK，CQC91两组中含量最高，且显著高于其他各组(P<0.05)；CQC28组的异戊酸含量显著低于其他各组(P<0.05)；CQC91组的乙酸/丙酸值显著高于其他各组(P<0.05)，CQC64组的乙酸/丙酸的值显著低于其他各处理组(P<0.05)；

本试验中，pH范围在7.1～7.4，CQC37组的pH值最高，且显著高于其他处理组(P<0.05)，CQC01组pH值显著低于其他处理组(P<0.05)。CQC91组的NH3-N含量高于CK组，但差异不显著。

表5 不同比例全株藜麦与全株玉米混合青贮饲料体外混合培养48 h后发酵特性Table 5 Fermentation characteristics of mixed silage of whole quinoa and corn in different proportions after in vitro mixed culture for 48 h

2.7 灰色关联度综合评价

由表6可知，不同比例全株藜麦与全株玉米混合青贮饲料的关联值排序为CQC91组>CK组> CQC46组> CQC19组> CQC01组> CQC82组> CQC55组> CQC64组> CQC37组> CQC73组> CQC28组，且不同比例全株藜麦与全株玉米混合青贮饲料的加权关联度排序顺序与等权关联度排序一致。

表6 不同比例全株藜麦与全株玉米混合青贮饲料的关联度及排序Table 6 Correlation degree and order of mixed silage of whole quinoa and corn in different proportions

3 讨论

3.1 不同混合比例青贮饲料的营养品质

粗蛋白和粗脂肪的含量是生产中选择饲料的重要指标[19]，其含量的高低会影响动物的生长速度和饲料转化率[20]。粗灰分是饲料中矿物元素的氧化态，在被动物摄入后为机体提供矿物质元素[21]。本试验中，粗蛋白的含量随着全株藜麦含量的降低而降低，是因为藜麦的蛋白含量高于玉米，这与汪晓璇[22]的研究相同。粗灰分含量随着试验中藜麦含量的降低而逐渐降低，这说明藜麦相对于玉米，含量较高的矿物质元素。这与的魏爱春等[23]的研究结果相同。

3.2 不同混合比例青贮饲料的产气参数和GP

Menke等[13]认为体外发酵产气量的多少与饲料中有机物的成分的发酵强度呈明显的正比关系，产气量是评价饲料营养价值的一项重要指标。当产气量越高时，也说明饲料中可利用的营养成分越多。本试验中，单一藜麦的a、b、a+b值低于单一全株玉米值，说明玉米较藜麦有更好的产气性能。各组合饲料中，随着全株玉米含量的增加，a + b值相应也随着增加，当藜麦与全株玉米比例为60∶40时，a + b值大于其他各组，这可能是饲料间的组合效应所致。在产气前24 h，所有组的产气速度较快，袁翠林[24]研究中也得到了相同的结果，在产气24 h后，各组的产气速度相对稳定。同时CQC46组CQC64组、CQC28组三个组的产气量显著高于单一藜麦(CK)组和单一玉米(CQC01)组，这说明合理的饲料组合可以提高饲料的利用率。

3.3 不同混合比例青贮饲料的IVDMD、pH及NH3-N含量

瘤胃干物质降解率(IVDMD)反映的是动物对饲料消化的难易程度。饲料中合适的纤维含量可以刺激瘤胃收缩和肠道蠕动，增加饲料通过瘤胃的时间，进而提高饲料的降解率[25]。本试验中，单一全株藜麦的干物质降解率低于单一全株玉米，在进行最佳组合后，CQC64组干物质降解率较单一全株藜麦(CK)组及单一全株玉米(CQC01)组都有所提高，这可能是此时的瘤胃pH更有利于纤维消化。

瘤胃内pH作为反映瘤胃发酵水平的一综合性指标，其过高过低都会降低瘤胃的发酵性能。根据张昌吉[26]等研究说明，瘤胃pH的值一般在5.5～7.5范围内，当pH不在此范围内时，会影响纤维分解霉的活性从而降低瘤胃对纤维的消化率。本试验的pH在6.5～7.5的范围内，适合瘤胃微生物的生长和瘤胃发酵，同时，Hoover和Stocks[27]发现适合瘤胃消化纤维和干物质的最适pH为6.5，本试验pH结果与此相似，并随着全株玉米含量的增加，pH逐渐降低，接近于Hoover研究的最适pH值，表明发酵效果良好，各混合饲料适合瘤胃发酵。

瘤胃中的氨态氮(NH3-N)含量能反映饲料原料蛋白质的消化情况[28]，它是生物蛋白合成与蛋白质降解间的一个动态平衡，因饲料种类的不同，其会表现出大幅度的变动。维持合适的NH3-N浓度是保证瘤胃微生物蛋白合成的重要前提[29]，本试验的氨态氮(NH3-N)含量在26.33～28.96 mg/dL之间，与郑琛[30]研究的瘤胃内的氨态氮(NH3-N)含量应该在10～50 mg/dL范围内的结果相同。同时在随着藜麦混合比例的降低，试验中的氨态氮(NH3-N)含量有随之降低的趋势，这可能是由于藜麦的蛋白含量较高，而全株玉米的蛋白含量较低的原因。

3.4 不同混合比例青贮饲料的瘤胃发酵特性变化

挥发性脂肪酸(VFA)是瘤胃碳水化合物发酵的主要产物，是反映微生物活性的重要指标，主要有维持瘤胃内环境稳定和为反刍动物机体提供70%～80%的能量等主要作用[31]。在本试验中，CQC19组TVFA含量高于其他组，其变化与GP的变化趋势呈现出正相关。此结果与唐德富等[32]的研究结果相似。同时乙酸/丙酸的值反映瘤胃的发酵类型。本试验中，乙酸/丙酸的值在1.5～2.2的范围内，根据李宗军[33]研究表明，丙酸发酵可以为动物机体提供较高的能量效率，其提供的能量高于乙酸和丁酸所能提供的。所以藜麦和全株玉米青贮组合可以有效提高瘤胃对饲料的能量转化效率，更好的为动物机体供能。CQC64组的乙酸/丙酸的值显著低于其他各组，这表明可以该组合为可以为机体更高效的功能。

3.5 灰色关联度分析

该混合青贮饲料的营养品质和发酵品质在全株藜麦与全株玉米的比例不同时，其结果呈现出一定的差异性，仅凭其中的一个指标难以筛选出最优的青贮混合比例。而灰色关联度分析法可以将离散、不便于归纳的信息进行处理后，转化为可以帮助我们分析的有用信息[34]。目前该方法广泛运用于各个领域，特别在品种筛选和品比试验中运用较为成熟[35-37]。利用灰色关联度分析法通过对本试验中的11组全株藜麦与玉米不同混合青贮饲料的 17项指标进行灰色关联度评价模型的构建，可以将各营养品质及发酵品质综合分析[28]，更加合理科学的筛选出全株藜麦与玉米最优的青贮比例。本试验中，根据关联度排序可知，CQC91组的青贮效果最好，CQC10组的青贮效果其次，CQC28组效果最差。

4 结论

通过比较不同比例混合的全株藜麦和全株玉米青贮组合发现，全株藜麦与全株玉米混合比例为90∶10时，该青贮饲料组合的粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)含量显著高于其他各组，该组合的乙酸(AA)、总挥发性脂肪酸(TVFA)含量以及氨态氮(NH3-N)浓度显著高于其他各处理组，可作为优质饲料组合在生产实践中推广应用。