FOXM1促进子宫内膜癌细胞系HEC-1B增殖、迁移和侵袭

黄 博，程苾恒，解美婷，刘珊汕，魏 敏

(湖北省人民医院 妇产科，湖北 武汉 430000)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma)是常见的妇科恶性肿瘤，目前手术仍是其主要的治疗方法[1]。Forkhead家族转录因子叉头框蛋白M1(forkhead box protein M1，FOXM1)作为调控细胞周期的癌基因，对肿瘤的病理改变起促进作用，并对肿瘤的生长、侵袭与转移具有调控作用[2]。有研究发现，FOXM1是一种细胞增殖特异性转录因子，与非恶性前列腺上皮细胞相比，其在前列腺癌细胞中高表达，提示FOXM1异常过表达有助于前列腺癌的发生发展[3]。另有研究发现，宫颈癌细胞中抑制FOXM1的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和药物敏感性[4]。然而，FOXM1对子宫内膜癌的影响目前研究甚少，本研究探讨抑制FOXM1的表达对子宫内膜癌细胞系HEC-1B增殖、迁移和侵袭的影响，为子宫内膜癌的临床治疗提供新靶点的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：选择人子宫内膜癌细胞系HEC-1B和人正常子宫内膜上皮细胞系hEECs，购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。

1.1.2 实验试剂：LipofectamineTM2000(上海碧云天生物技术有限公司)；siRNA-NC和siRNA-FOXM1(上海吉玛制药技术有限公司)；Trizol(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；CCK8试剂盒(苏州瑞诺德生物科技有限公司)；FOXM1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、GAPDH上下游引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；FOXM1兔多克隆抗体(Abcam公司)；VEGF、bFGF兔多克隆抗体、山羊抗兔二抗(LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及转染：子宫内膜癌细胞系HEC-1B，培养于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%、含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。取对数生长期细胞，采用LipofectamineTM2000进行转染。根据转染质粒的不同，将细胞分为3组：空白对照组(不转染，细胞正常生长)、阴性对照组[转染100 nmol/L siRNA-negative control(NC)]、siRNA-FOXM1组(转染100 nmol/L siRNA-FOXM1)，分别于转染48 h后收集细胞。

1.2.2 实时荧光定量PCR：Trizol法提取各组细胞总RNA，并测定RNA的浓度和纯度，根据反转录试剂盒说明书进行操作，将RNA反转录为cDNA，取1 μL cDNA采用SYBR Green RT-qPCR试剂盒进行基因检测。FOXM1上游引物为：5′-TGCCCAGCAG TCTCTTACCT-3′，下游引物为：5′-CTACCCACCTTC TGGCAGTC-3′；VEGF上游引物为：5′-AGGGCAGAA TCATCACGAAGT-3′，下游引物为：5′-AGGGTCTC GATTGGATGGCA-3′；bFGF上游引物为：5′-TATTT CTTTGGCTGTACTTG-3′，下游引物为：5′-TCCAGC ATTTCGGTGTTG-3′；GAPDH上游引物为：5′-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物为：5′-AAGAT GATGGATTTC-3′。反应体系：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。按公式(2-△△Ct法)计算各组细胞FOXM1、VEGF和bFGF mRNA相对表达量。

1.2.3 CCK8法检测实验：收集转染48 h的细胞，接种于96孔板(每孔2×103个细胞)。然后分别于0、24、48、72 h培养细胞，加入10 μL CCK-8试剂。再孵育2 h后，用酶标仪测量每个孔在450 nm吸收波长下的吸光度值(A)。

1.2.4 细胞划痕实验：在6孔板背面用记号笔均匀划线，每隔0.5～1.0 cm划一道，每道线均横穿过孔。在孔中加入约1×105个细胞，加入培养液过夜孵育。用枪头垂直于6孔板划线，PBS洗涤细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基置于37 ℃培养箱培养，24 h观察拍照，观察细胞的迁移情况，实验重复3次。

1.2.5 Transwell小室法检测细胞侵袭实验：取300 μL无血清培养基加入30 μL基质凝胶，混匀后铺于Transwell小室的上室内，调节各组细胞浓度为1×106个/mL，各取200 μL加入上室内，下层小室内加入600 μL培养液，常规培养24 h；取出Transwell用PBS洗涤3遍，用0.4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色10 min，PBS洗涤3次，显微镜下观察并计数穿膜细胞数，实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测实验：BCA法检测各组细胞蛋白浓度。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE，湿转至PVDF膜后用5%脱脂牛奶封闭，2 h后TBST缓冲液漂洗；分别与VEGF、bFGF、β-actin蛋白特异性一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜后，TBST缓冲液漂洗，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育后ECL化学发光剂显色。Image J分析软件计算各组细胞目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组细胞FOXM1 mRNA及蛋白表达水平

与人正常子宫内膜上皮hEECs细胞相比，人子宫内膜癌HEC-1B细胞FOXM1 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05)(图1)。siRNA-FOXM1组FOXM1 mRNA和蛋白表达与空白对照组和阴性对照组相比显著降低(P<0.05)(图2)。

A.expression of FOXM1 protein was analyzed by Western blot;B.expression of FOXM1 mRNA was analyzed by RT-qPCR;*P<0.05 compared with hEECs cells图1 hEECs和HEC-1B细胞FOXM1 mRNA及蛋白表达水平Fig 1 Expression of FOXM1 mRNA and protein in hEECs and HEC-1B n=3)

A.expression of FOXM1 protein was analyzed by Western blot;B.expression of FOXM1 mRNA was analyzed by RT-qPCR;*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with NC control图2 转染后HEC-1B各组细胞FOXM1 mRNA及蛋白表达水平Fig 2 Expression of FOXM1 mRNA and protein in each group of HEC-1B cells after n=3)

2.2 转染后各组细胞的增殖能力

24、48和72 h siRNA-FOXM1组HEC-1B细胞增殖较空白对照组和阴性对照组显著降低(P<0.05)(表1)。

表1 转染后HEC-1B各组细胞的增殖能力Table 1 Proliferation ability of cells in each group of HEC-1B cells after transfection(A, n=3)

2.3 转染后各组细胞的迁移能力

siRNA-FOXM1组HEC-1B细胞划痕宽度与空白对照组和阴性对照组相比显著变宽，划痕宽度比显著增加(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组相比差异无统计学意义(图3)。

*P<0.05 compared with blank control group;#P<0.05 compared with NC control group图3 转染后HEC-1B各组细胞的迁移能力Fig 3 Migration ability of cells in each group of HEC-1B cells after transfection(×200, n=3)

2.4 转染后各组细胞的侵袭能力

与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA-FOXM1组HEC-1B细胞穿过Transwell小室的细胞数显著减少，侵袭能力减弱(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组相比差异无统计学意义(图4)。

*P<0.05 compared with blank control group;#P<0.05 compared with NC control group图4 转染后HEC-1B各组细胞的侵袭能力Fig 4 Invasion ability of cells in each group of HEC-1B cells after transfection(×200, n=3)

2.5 转染后各组细胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白表达

与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA-FOXM1组HEC-1B细胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白表达均显著降低(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组相比，HEC-1B细胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白表达无差异(图5)。

A.expression of VEGF and bFGF protein was analyzed by Western blot;B.expression of VEGF and bFGF mRNA was analyzed by RT-qPCR;*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with NC control图5 转染后HEC-1B各组细胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白表达Fig 5 mRNA and protein expression of VEGF and bFGF of cell in each group of HEC-1B cells after transfection

3 讨论

FOXM1是一种原癌基因，在各类癌中高表达。由于它可在不同类型的癌细胞中调节肿瘤生长、血管生成和转移等，在肿瘤发生中发挥不同的作用[5-6]。RNA干扰技术是一种基于靶基因同源双链RNA对生物体内基因序列的特异性沉默能力的一种基因技术，是临床肿瘤靶向治疗研究热点之一[7]。有研究表明，FOXM1的表达与结肠癌的侵袭、转移有关，siRNA干扰FOXM1可有效抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[8]。有研究[9]发现，抑制FOXM1基因的表达可明显降低鼻咽癌细胞增殖水平，诱导细胞凋亡，并提高细胞对紫杉醇的敏感性。本研究结果发现，干扰FOXM1表达后，HEC-1B细胞增殖、迁移和侵袭能力均减弱，提示降低FOXM1的表达可抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭水平。

肿瘤的发生、发展及转移依赖于新生血管和淋巴管的生成，VEGF是与肿瘤相关的重要的血管因子，而bFGF是细胞生长分化的重要调节因子，VEGF和bFGF 具有协同促进肿瘤生长和转移的作用[10]。有研究[11]发现，宫颈癌组织中VEGFA、VEGFB和VEGFC高表达，且与FOXM1的表达呈正相关，表明VEGFA、VEGFB和VEGFC可能是FOXM1下游的靶基因。另有研究发现，抑制FOXM1可通过下调VEGF、MMP-9和MMP-2抑制乳腺癌细胞的侵袭性、迁移和血管生成能力[12]。本研究结果发现，siRNA-FOXM1组VEGF、bFGF mRNA及蛋白表达均显著降低，提示FOXM1可通过调控VEGF、bFGF的表达发挥作用。

综上所述，抑制HEC-1B细胞中 FOXM1的表达可以抑制细胞的增殖、迁移及侵袭能力，其机制可能是通过抑制VEGF、bFGF的表达发挥作用，为治疗子宫内膜癌的研究提供新思路。然而FOXM1是否进一步影响VEGF下游相关信号通路有待深入研究。