miR-493-5p抑制人卵巢癌细胞系SKOV3增殖和迁移

李少儒，秦海霞，刘珊珊，侯瑞杰

(新乡医学院第一附属医院 妇产科，河南 新乡 453100)

卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，研究表明miRNA与卵巢癌的发生发展相关[1]。miR-493-5p的过表达通过下调类Kruppel因子5(Kruppel-like factor 5，KLF5)并使磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3 kinese/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路失活而抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移[2]。高表达miR-493-5p通过调控囊泡相关膜蛋白2(vesicle-associated membrane protein-2，VAMP2)抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导其衰老凋亡[3]。然而miR-493-5p对卵巢癌的影响及机制尚不清楚。G蛋白偶联受体激酶相互作用因子1(G-protein-coupled receptor kinase interactor-1，GIT1)是介导各种肿瘤进展的多功能支架蛋白，研究发现，GIT1可促进肝癌细胞的侵袭、迁移和增殖[4]。miR-149-5p可通过靶向GIT1抑制甲状腺髓样癌中的细胞增殖和侵袭[5]。而GIT1对卵巢癌的影响也尚不清楚。本实验通过在线生物信息学软件预测发现miR-493-5p与GIT1有结合位点，因此，本实验旨在研究miR-493-5p/GIT1对卵巢癌细胞系增殖和迁移的影响以及miR-493-5p是否通过调控GIT1影响卵巢癌细胞系的增殖和迁移。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌细胞系A2780、SKOV3及OVCAR3和人卵巢上皮细胞系IOSE80(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；胎牛血清、RPMI-1640培养基(上海谷研实业有限公司)；胰蛋白酶(广州威佳科技有限公司)；Trizol试剂、反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)；MTT试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)；BCA试剂盒(上海经科化学科技有限公司)；双荧光素酶报告实验试剂盒(GeneCopoeia公司)；Transwell小室、Matrigel(上海代轩生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：常规培养卵巢癌A2780、SKOV3、OVCAR3细胞和人卵巢上皮IOSE80细胞，取对数增殖期卵巢癌SKOV3细胞，将miR-con、miR-493-5p mimics、anti-miR-con、anti-miR-493-5p转染至SKOV3细胞中，记为miR-con组、miR-493-5p组、anti-miR-con组、anti-miR-493-5p组；将miR-493-5p mimics分别与pcDNA、pcDNA-GIT1共转染至SKOV3细胞中，记为miR-493-5p+pcDNA组、miR-493-5p+pcDNA-GIT1组。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-493-5p和GIT1 mRNA表达水平：提取各组细胞的总RNA，合成cDNA，按试剂盒说明进行PCR，以β-actin为内参，2-△△Ct法计算相对表达量。miR-493-5p上游引物序列：5′-TTGT ACATGGTAGGCTTTCATT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；GIT1上游引物序列：5′-GCCGACAGTGACTATGAGAA-3′，下游引物序列：5′-AGTTCCTGAATGTTCTTGGT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

1.2.3 Western blot检测蛋白的表达：提取各组细胞的总蛋白，BCA定量，经SDS-PAGE，转膜，封闭；加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，曝光、显影、定影，Quantity One分析蛋白条带，以β-actin为内参计算目的蛋白相对表达水平。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖：培养各组细胞至24、48 和72 h时，按试剂盒说明操作，先加入MTT溶液20 μL，孵育4 h后加入DMSO 150 μL，振荡反应10 min，用酶标仪检测490 nm处吸光度(A)值。

1.2.5 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭：Transwell上室和下室分别加入200 μL细胞悬液和500 μL完全培养基，培养24 h，甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，在显微镜下观察并计算迁移细胞数。细胞侵袭实验：用Matrigel包被Transwell上室，按照细胞迁移实验步骤操作。

1.2.6 荧光素酶报告基因检测实验检测miR-493-5p对GIT1的靶向调控：合成含miR-493-5p结合位点的GIT1的3′UTR序列片段，插入至荧光素酶表达载体中，获得GIT1野生型载体(WT-GIT1)，将GIT1序列 CUGUCAAGACGUGUCAUGUACAU突变为CUGUCAAGACGUGUGUGUACAUGUU，获得GIT1突变型载体(MUT-GIT1)，将WT-GIT1、MUT-GIT1分别与miR-NC、miR-493-5p共转染至卵巢癌SKOV3细胞中，转染48 h后，检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-493-5p和GIT1在卵巢癌细胞系中的表达

与IOSE80细胞相比，A2780、SKOV3、OVCAR3细胞中miR-493-5p表达水平降低，GIT1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)(图1)。因miR-493-5p和GIT1 在SKOV3细胞中表达差异显著，故后续试验均在SKOV3细胞中进行。

A.qRT-PCR to detect the expression level of miR-493-5p;B.qRT-PCR to detect the expression level of GIT1;C.Western blot to detect the expressions of GIT1;*P<0.05 compared with IOSE80 group图1 miR-493-5p和GIT1在卵巢癌细胞系中的表达Fig 1 miR-493-5p and GIT1 protein expression in ovarian cancer cell lines(n=9)

2.2 过表达miR-493-5p对卵巢癌细胞增殖和迁移的功能性影响

与miR-con组相比，miR-493-5p组卵巢癌细胞中miR-493-5p表达水平升高(P<0.05)，细胞活性降低(P<0.05)，细胞迁移和侵袭数量降低(P<0.05)(图2)。

A.qRT-PCR to detect the transfection efficiency of miR-493-5p;B.MTT to detect cell proliferation;C,D.Transwell test to detect the migration and invasion of SKOV3 cells;E,F.Western blot to detect the expressions of cyclinD1 and MMP-2;*P<0.05 compared with miR-con group图2 过表达miR-493-5p对SKOV3细胞增殖和迁移及cyclin D1、MMP-2的表达量的影响Fig 2 Effect of over-expression of miR-493-5p on the proliferation and metastasis of SKOV3 cells and the expression of cyclin D1 and MMP-2

2.3 miR-493-5p靶向GIT1并抑制GIT1蛋白质的表达

TargetScan预测显示GIT1的3′UTR与miR-493-5p具有互补的核苷酸序列(图3A)。相较于miR-con组，miR-493-5p组转染野生型GIT1载体的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)(图3B)。相较于miR-con组，miR-493-5p组GIT1表达水平降低；相较于anti-miR-con组，anti-miR-493-5p组GIT1表达水平升高(P<0.05)(图3C)。

A.TargetScan database predicts the presence of binding sites between GIT1 and miR-493-5p;B.dual luciferase activity detection;C.Western blot detection of GIT1 expression in SKOV3 cells transfected with miR-493-5p or anti-miR-493-5p;*P<0.05 compared with miR-con group;#P<0.05 compared with anti-miR-con group图3 miR-493-5p靶向GIT1并抑制其蛋白表达Fig 3 miR-493-5p targets and inhibits expression of GIT1

2.4 过表达GIT1部分逆转miR-493-5p对卵巢癌细胞增殖及转移的功能性影响

与miR-con组相比，miR-493-5p组细胞活性降低，细胞迁移和侵袭数量降低(P<0.05)；与miR-493-5p+pcDNA组相比，miR-493-5p+pcDNA-GIT1组miR-493-5p表达水平降低(P<0.05)，细胞活性升高(P<0.05)，细胞迁移和侵袭数量升高(P<0.05)(图4)。

A.Western blot to detect the transfection efficiency of GIT1;B.MTT to detect the proliferation of SKOV3 cells;C,D.Transwell experiment to detect the migration and invasion of SKOV3 cells;E.Western blot to detect cyclinD1 and MMP-2 expression in SKOV3 cells;*P<0.05 compared with miR-con group;#P<0.05 compared with miR-493-5p+pcDNA group图4 过表达GIT1减弱miR-493-5p对SKOV3细胞增殖和迁移及cyclin D1、MMP-2的表达量的影响Fig 4 Over-expression of GIT1 attenuates the effect of miR-493-5p on the expression of GIT1,cyclin D1 and MMP-2 in SKOV3 cells

2.5 miR-493-5p靶向GIT1基因对MEK1/2-ERK1/2信号通路的影响

与miR-con组相比，miR-493-5p组卵巢癌细胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-c-Jun、p-c-Fos 表达水平降低；与miR-493-5p+pcDNA组相比，miR-493-5p+pcDNA-GIT1组卵巢癌细胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-c-Jun、p-c-Fos表达水平升高(P<0.05)(图5)。

*P<0.05 compared with miR-con group;#P<0.05 compared with miR-493-5p+pcDNA group图5 Western blot检测miR-493-5p靶向GIT1基因对MEK1/2-ERK1/2信号通路的影响Fig 5 Western blot detection of the effect of miR-493-5p targeting GIT1 gene on MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway

3 讨论

分子靶向治疗在恶性肿瘤的治疗中占据重要地位，更多的研究筛查了与卵巢癌发生发展密切相关的分子靶点，开发特异性靶向药物，有利于卵巢癌的治疗[6]。miRNA的异常表达与卵巢癌的发生发展密切相关，可作为卵巢癌早期诊断与预后判断的新靶点[7]。miR-493-5p通过靶向FUT4减弱人乳腺癌的侵袭性和致瘤性[8]；miR-493-5p过表达通过负调节VAMP的表达来促进细胞凋亡并抑制肝癌细胞的增殖和迁移[9]。本实验结果表明，miR-493-5p在多种卵巢癌细胞系中低表达，过表达miR-493-5p抑制了卵巢癌细胞SKOV3增殖、迁移和侵袭；表明miR-493-5p在卵巢癌中起抑癌作用。

GIT1参与细胞运动激活，这是组织发育和癌进展过程中的基本过程，GIT1高表达通过调节Rac1/Cdc42活性促进肺癌细胞转移，且与肺癌患者预后不良有关[10]。抑制GIT1可减少骨肉瘤的增殖，侵袭[11]。本实验结果显示，GIT1在卵巢癌细胞高表达，过表达GIT1促进了细胞增殖、迁移和侵袭。本实验还发现miR-493-5p可靶向调控，且过表达GIT1减弱了miR-493-5p对卵巢癌细胞增殖和转移的影响，说明miR-493-5p可能通过调控GIT1影响卵巢癌进展。

MEK1/2-ERK1/2是恶性肿瘤发生和发展中有重要作用的一条信号通路[12]。ERK12参与了从G1期到S期的细胞周期进程，其增强卵巢癌细胞的存活率和对顺铂耐药性[13]。miR-638的靶标MeCP2通过上调GIT1激活MEK12-ERK12信号通路，促进胃癌细胞增殖并诱导细胞周期进程[14]。本实验中过表达miR-493-5p抑制了MEK1/2-ERK1/2信号通路的激活，而过表达GIT1减弱了这一作用，以上结果表明，miR-493-5p对SKOV3卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响可能与调控GIT1进而调节MEK1/2-ERK1/2信号通路相关。

综上所述，miR-493-5p可抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与靶向调控GIT1以及MEK1/2-ERK1/2信号通路有关。