苦参碱对人乳头状甲状腺癌细胞系TPC-1增殖和迁移的影响

傅松波，马承旭，井高静，赵 楠，汤旭磊*，牟军勤，常寅龙

(1.兰州大学第一医院 内分泌科，甘肃 兰州 730000；2.兰州市城关区人民医院 内分泌科，甘肃 兰州 730030)

乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)10～15年的存活率达到85%，预后良好。然而，部分乳头状甲状腺癌患者会发展到侵入邻近组织(如淋巴结)，预后较差[1]。因此，阐明部分乳头状甲状腺癌侵袭转移的分子机制和开发具有诊断及判断乳头状甲状腺癌预后的分子标志物具有重要意义。miRNA表达谱揭示差异表达的miR-182-5p和乳头状甲状腺癌的临床复发密切相关[2]，miR-182的表达水平比正常甲状腺组织增加3倍[3]，其在乳头状甲状腺癌癌变中起致癌作用。

苦参碱(matrine)具有诱导肿瘤细胞周期停止[4]、增加肿瘤细胞的凋亡、降低肿瘤细胞的增殖[5]和迁移[6]等作用，具有抗多种肿瘤细胞活性。本研究表明苦参碱显著的降低TPC-1中miR-182-5p的表达，但是，苦参碱治疗乳头状甲状腺癌的分子机制是否与miR-182-5p相关尚未报道，本文将探讨苦参碱降低miR-182-5p的表达对乳头状甲状腺癌TPC-1细胞系增殖和迁移的影响，为临床应用苦参碱治疗乳头状甲状腺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂及细胞

苦参碱(大连美仑生物技术有限公司)；RPMI-1640培养基、DMEM培养液、胰蛋白酶和血清(Gibco公司)；CCK-8试剂盒(北京同仁生物科技有限公司)；Transwell小室(康宁生物科技有限公司)；EndoFectin-Max 转染试剂、miR-182-5p mimics及miR-182-5p抑制剂(GeneCopoeia公司)，E-cadherin、N-cadherin和vinmentin抗体(Abcam公司)。人甲状腺正常细胞系Nthy-ori 3-1和人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1(北京北纳创联生物技术研究院)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：分为两大组，1)药物处理组(分别用0、0.25、0.5和1 mg/mL的苦参碱处理TPC-1细胞)；2)转染组(将TPC-1细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后行细胞转染实验并分为抑制剂对照组(inhibitor-NC)、miR-182-5p的抑制剂组(inhibitor)、模拟物对照组(mimics-NC)和miR-182-5p 模拟物组(miR-182-5p mimics)。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖：将转染组(6×103个/孔)的TPC-1细胞接种于96孔板，其中mimics-NC和miR-182-5p mimics组的TPC-1贴壁后加入或者不加入0.5 mg/mL的苦参碱，于37 ℃、5% CO2条件下分别培养0、24、48及72 h,加入10 μL CCK-8试剂，继续孵育4 h，读取波长450 nm处各组细胞的吸光度值。

1.2.3 采用Transwell小室法检测TPC-1细胞的迁移：将8×103个/室的转染组的TPC-1细胞接种于小室上面，每室约100 μL，下面添加DMEM培养基，其中mimics-NC和miR-182-5p mimics组的TPC-1细胞贴壁后，向小室下面添加或者不添加0.5 mg/mL的苦参碱，置37 ℃、孵育48 h，取出小室，置24孔板，PBS漂洗2次，固定10 min，染色15 min，观察TPC-1细胞的迁移并计数。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测miR-182-5p、E-cadherin、N-cadherin和vinmentin基因表达：从上述各组细胞中提取RNA，反转录合成cDNA，采用Bio-Rad CFX Manager3.1 PCR仪扩增，分析miR-182-5p、E-cadherin、N-cadherin和vinmentin的表达，采用2-ΔΔCt方法分析目的基因的相对表达水平。

1.2.5 采用Western blot检测vinmentin、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达：提取各处理组总蛋白，SDS-PAGE分离，转膜，用一抗二抗标记，检测分离的目的蛋白条带。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-182-5p在TPC-1细胞中上调表达水平

TPC-1细胞中miR-182-5p表达量显著地高于NT组(P<0.01)。

2.2 miR-182-5p的下调抑制TPC-1细胞的增殖及迁移

在TPC-1细胞中转染miR-182-5p inhibitor，24、48和72 h后，inhibitor组TPC-1细胞A450 nm吸光度值均显著地低于inhibitor-NC组；inhibitor组迁移的TPC-1细胞明显少于inhibitor-NC组(P<0.01)(图1)。

*P<0.01 compared with inhibitor-NC图1 miR-182-5p对TPC-1细胞增殖和迁移的影响Fig 1 Effect of miR-182-5p on proliferation and migration of TPC-1 n=5 or n=3)

2.3 苦参碱降低了miR-182-5p表达和TPC-1细胞的增殖、迁移

与control组相比，剂量为0.5和1 mg/mL的苦参碱均抑制TPC-1细胞中miR-182-5p表达(P<0.01)，且0.5 mg/mL苦参碱的抑制效果最好；与control组相比，0.5 mg/mL苦参碱在24、48和72 h均显著地抑制TPC-1细胞增殖；0.5 mg/mL的苦参碱治疗TPC-1细胞，48 h后，迁移的TPC-1细胞明显少于control组(P<0.01)(图2)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group图2 苦参碱影响了TPC-1细胞中miR-182-5p的表达、增殖和迁移Fig 2 Effect of matrine on miR-182-5p level and proliferation and migration of TPC-1 n=5 or n=3)

2.4 TPC-1细胞系中miR-182-5p的上调降低了苦参碱对增殖和迁移的抑制作用

与mimics-NC相比，mimics-NC+苦参碱组TPC-1细胞A450 nm吸光度值显著地降低(P<0.01)；与mimics-NC+苦参碱组相比，miR-182-5p mimics+苦参碱组A450 nm处吸光度显著地升高(P<0.01)。与mimics-NC相比，mimics-NC+苦参碱组穿透小室TPC-1细胞数量明显减少(P<0.01)；与mimics-NC+苦参碱组相比，miR-182-5p mimics+苦参碱组穿透小室TPC-1细胞数量明显增多(P<0.01)(图3)。

*P<0.01 compared with mimics-NC group；#P<0.01 compared with mimics-NC+matrine group图3 TPC-1细胞中miR-182-5p的上调对苦参碱抑制效果的影响Fig 3 Effect of matrine on proliferation and migration of TPC-1 cells when miR-182-5p over-expression

2.5 miR-182-5p的上调降低了苦参碱对Vinmentin和N-cadherin的抑制、对E-cadherin表达的促进作用

在TPC-1细胞中，与mimics-NC组相比，mimic-NC+matrine组Vvinmentin和N-cadherin的蛋白表达明显降低、E-cadherin的蛋白表达升高；与mimic-NC+matrine组相比，miR-182-5p-mimic+matrine组vinmentin和N-cadherin的表达水平上升、E-cadherin的蛋白表达水平降低(图4)。

A.mimic-NC;B.miR-182-5P-mimic;C.mimic-NC+matrine;D.miR-182-5P-mimic+matrine图4 miR-182-5p的过表达降低了苦参碱对vinmentin、N-cadherin和E-cadherin的调节作用Fig 4 Over-expression of miR-182-5p abolished the matrine-induced the decrease in N-cadherin and vinmentin protein expression as well as the increase in E-cadherin protein expression

在TPC-1细胞系中，与mimics-NC相比，mimic-NC+matrine组N-cadherin表达量降低(P<0.05)、E-cadherin表达增加(P<0.01)；与mimic-NC+matrine组相比，miR-182-5p-mimic+matrine组N-cadherin基因表达量显著地增加、E-cadherin基因表达极显著地降低(P<0.01)。苦参碱对vinmentin表达模式的调节作用与N-cadherin一致(表1)。

表1 miR-182-5p的过表达降低了苦参碱对TPC-1细胞中E-cadherin、N-cadherin 和 vinmentin的影响Table 1 Over-expression of miR-182-5p abolishes the matrine-induced the decrease of N-cadherin and vinmentin gene expression as well as the increase of E-cadherin gene n=3)

3 讨论

乳头状甲状腺癌在生物学上属于“惰性肿瘤”，但部分甲状腺癌易发展为侵袭性。甲状腺癌细胞恶性增殖和获得迁移表型是一个未受到调控的复杂过程。miRNA既可以促进癌细胞的转移也可以抑制癌细胞的转移，在调控甲状腺癌细胞的增殖、分化和凋亡等生物学行为中发挥双重角色[7]。本研究结果显示：在TPC-1细胞系中，miR-182-5p的表达显著增加，且抑制miR-182-5p的表达降低了TPC-1细胞的增殖和迁移，提示miR-182-5p具有导致人乳头状甲状腺癌细胞恶性生物学行为的能力。

苦参碱是一种广泛应用的抗肿瘤药物，能抑制甲状腺癌细胞的恶性病理行为(抑制肿瘤细胞生长、肿瘤组织侵袭及组织内新血管生成等)，诱导肿瘤细胞凋亡[8-10]，我们研究用剂量为0.5和1 mg/mL的苦参碱治疗TPC-1细胞，表明苦参碱的剂量为0.5 mg/mL时明显地抑制了miR-182-5p的表达，同时降低了TPC-1细胞系的增殖和迁移，过表达TPC-1细胞中miR-182-5p，苦参碱的抑制效果被降低。提示苦参碱通过降低TPC-1细胞中miR-182-5p发挥治疗乳头状甲状腺癌的作用。

人乳头状甲状腺癌细胞的侵袭和转移与甲状腺癌临床复发事件密切相关，癌细胞经历了上皮间充质转换，获得了迁移表型，以E-cadherin的下调和N-cadherin的上调为分子基础，为甲状腺癌细胞具有侵袭和转移的能力提供了必要的条件[11]。本研究发现苦参碱逆转了TPC-1细胞中E-cadherin和N-cadherin的表达模式，从而降低TPC-1细胞获得迁移表型的能力，抑制上皮间充质转化。虽然苦参碱能够调节上述分子的表达，但这些变化的分子哪些分子可能是miR-182-5p的潜在靶标还需进一步的实验(例如荧光素酶报告试验)证实。