基于正交实验优化朱日亨滴丸提取工艺

张 谦，李 君，王跃武

朱日亨滴丸原处方是蒙医临床验方，是在我国《部颁标准（蒙药分册）》中赞旦-3（方药组成：广枣、肉豆蔻、檀香）的基础上演变而来的［1］，由广枣、红花、栀子、肉豆蔻、檀香、沉香、草果、牛黄、冰片共9味药材组成.该处方在临床作为医院院内制剂已使用多年，主治心热、心赫依、心刺痛和心慌气短等（即冠心病、心绞痛、心律不齐等）心血管疾病［2-4］.目前，该处方剂型为散剂，在临床应用存在服用剂量不均一、挥发性成分易散失、患者顺应性差、易吸潮变质等缺点；但其滴丸溶出速度快、起效迅速、生物利用度高，更宜于患者临床用药.为此，本文根据该处方中各味药材活性成分的性质进行了提取纯化，将原剂型改制成滴丸，具体制备工艺为：以乙醇提取广枣、红花、栀子3味药中有效成分，以CO2超临界萃取法收集肉豆蔻、檀香、草果、沉香4味药中的挥发油，牛黄、冰片2味药直接粉碎入药，再以聚乙二醇为基质，滴制而成［5-6］.

有研究报道［7］，提取工艺与中药制剂质量密切相关，提取工艺是否合理，提取技术运用是否精良，均可直接影响到药材中有效成分提取的收率.因此，优化提取工艺是生产中药制剂至关重要的一个环节［8］.为了最大程度提取药材中的有效成分，有必要以一种或者更多种药效成分为考察指标，通过实验筛选最佳的提取工艺，以确保工业化生产的药物达到最佳质量和临床疗效.正交试验是从多因素多水平角度出发筛选、优化中药复方提取工艺的常用方法，通过从全面试验中挑选代表性强的点进行试验，利用正交表均衡分散、整齐可比的特点，对各因素和各水平的优劣作出分析，最后根据试验结果确定最佳提取方案［9-10］.

在前期工作中，笔者对朱日亨滴丸的4种组分及2种配比进行了指标成分和药效活性相结合的正交筛选，以最佳组方制备成朱日亨滴丸［4］，但对其提取工艺未进行筛选和优化.因该复方制剂组方成分较多，具有成分多、靶点多、协同作用的特点，以多成分作为评价指标评价复方的提取工艺，可更合理地体现复方的整体性、复杂性和有效性.鉴于此，本研究采用正交试验筛选和优化朱日亨滴丸的最佳提取工艺，以期为该制剂工业化生产及临床用药的安全性、有效性提供科学依据.

1 仪器与试药

1.1 仪器

BSA224S型万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KH-500DV型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；DZTW型电子调温电热套（上海力辰邦西仪器科技有限公司）.

1.2 试药

所用试剂均为分析纯；水为蒸馏水；广枣（批号：20022403），栀子（批号：19122703），红花（批号：200101131），均购自内蒙古北域健康药房连锁有限公司，经内蒙古医科大学药学院中药资源教研室渠弼教授鉴定.

2 实验方法

2.1 色谱-质谱条件

色谱条件：InertSustain®C18色谱柱（3.0 mm×100 mm，3.0µm），柱温为35℃，流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~0.3 min，5%A；0.31~2.00 min，5%→15%A；2.01~5.00 min，15%→45%A；5.01~6.00 min，45%→95%A；6.01~7.50 min，95%A；7.50~7.51 min，95%→5%A；7.51~9.00 min，5%→5%A），流 速为0.25 mL·min-1，进样量为3µL.

质谱条件：ESI离子源负离子模式，定量分析采用多重反应离子监测（MRM），加热模块温度400℃，DL温度250℃，雾化气流速3.0 L·min-1，干燥气流速15 L·min-1，离子源电压4.0 kV.

2.2 供试品的制备

按处方比例称取朱日亨各味药材，置于圆底烧瓶中，加入60%乙醇溶液680 mL，于磁力加热搅拌电热套加热提取1 h，冷却至室温，取滤液用60%乙醇溶液定容至500 mL容量瓶中，取提取液10µL，于70%甲醇水溶液990µL中，涡旋混匀30 s，经0.22µm微孔滤膜滤过，即得供试品.

2.3 正交优化提取工艺

根据前期单因素试验及相关文献［11-12］，按L9（34）正交表进行试验.选取料液比（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，每个因素设置3个水平，如表1所示；朱日亨组方中广枣、栀子、红花分别占比56.25%、18.75%、25.00%，故综合评分=广枣中成分含量×56.25%+栀子中成分含量×18.75%+红花中成分含量×25.00%，以综合评分为考察指标评价提取工艺，评分越高表明提取效果越好.

2.4 最优提取条件放大验证试验

按处方比例称取朱日亨各味药材约680.00 g，共3份，置于圆底烧瓶中，按最佳提取工艺，分别加入60%乙醇溶液5 440 mL，于磁力加热搅拌电热套分别加热提取110 min，提取2次，冷却至室温，所得滤液于旋转蒸发仪浓缩至500 mL，取提取液10µL于990µL的70%甲醇水溶液中，涡旋混匀30 s，过0.22µm微孔滤膜，进样测定.

3 实验结果

3.1 正交优化提取工艺

由表2、表3可知，根据极差（R）大小，确定D因素对提取工艺影响最大，各因素对综合评分影响的主次顺序：D（提取次数）＞B（乙醇浓度）＞A（料液比）＞C（提取时间），通过4因素3水平K值分析比较可知，料液比A2＞A1＞A3，乙 醇 浓 度B3＞B2＞B1，提 取 时 间C3＞C2＞C1，提 取 次 数D3＞D2＞D1；根 据 方 差分析表4可知，A、B、C、D四个因素对其均无显著性影响（P＞0.05），可以确定最优提取工艺为A2B3C3D3，即 料 液 比1∶8 g·mL-1、乙 醇 浓 度60%、提取时间110 min、提取次数3次.方差分析见表4.

表1 因素水平表

表2 正交试验中7种指标成分含量（n=3） 单位：mg·g-1

表3 正交试验结果

3.2 最优提取条件放大验证试验

由表5可知，没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素、鞣花酸、西红花苷Ⅰ、山奈酚、栀子苷7种成分的含量分别为0.90 mg·g-1、17.04 mg·g-1、0.02 mg·g-1、0.70 mg·g-1、6.01 mg·g-1、0.03 mg·g-1、39.14 mg·g-1，RSD为3.32%~7.20%，综合评分为13.64.

4 讨论与结论

4.1 讨论

蒙古族国医大师苏荣扎布在心血管疾病治疗方面成果显著，其提出以“三根为核心”的心脑血管病整体观和“给血管活血化瘀”的临床治疗方法，治疗缺血性心肌病心血管疾病具有独特的疗效［13］.朱日亨滴丸是在苏荣扎布老师治疗冠心病、心绞痛的经典方剂赞旦-3味汤散（广枣、檀香和肉豆蔻）基础上，配伍若干镇赫依药味和清热药后，经CO2超临界萃取工艺制成的滴丸制剂.

广枣作为蒙医特色药材，性味甘、酸而平，内蒙古蒙成药标准中含广枣的方剂约占10%，其富含黄酮类成分，适宜以乙醇进行药效成分的提取；栀子为常用清热类药材，栀子苷是其主要药效成分，亦属于醇溶性成分；红花为活血化瘀类药材，含有查耳酮类黄酮类成分-红花黄色素，溶于稀乙醇和水［6］.鉴于上述各味药药效成分的理化性质，本文进行了醇提工艺研究，运用正交实验方法，以没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素、鞣花酸、西红花苷Ⅰ、山奈酚、栀子苷7种成分为控制指标，确定了最佳提取工艺：料液比1∶8 g·mL-1、乙醇浓度60%、提取时间110 min、提取次数3次.然而，由于后期中试及生产过程完全遵循本研究的醇提工艺参数，考虑到生产成本问题，同时，根据上述方差分析结果，从提取次数无显著性影响的角度出发，考察第3次提取过程中没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素等各药效成分增长百分比.结果表明，各种药效成分含量均不同程度地增加，即没食子酸（5.31%）、羟基红花黄色素A（3.33%）、槲皮素（6.52%）、鞣花酸（5.55%）、西红花苷Ⅰ（5.90%）、山奈酚（4.43%）、栀子苷（6.24%），故将最优工艺中提取次数确定为2次.上述工艺优化过程既考虑了广枣和栀子中有效成分的提取也避免了多次提取的高成本缺点.

表4 方差分析结果

表5 放大验证试验结果（n=3）

4.2 结论

本研究探讨了与醇提取法作用相关的料液比、乙醇浓度、提取时间、提取次数对朱日亨滴丸中没食子酸等7种成分含量的影响，采用正交试验筛选出该制剂的最佳提取工艺条件：料液比1∶8 g·mL-1、乙醇浓度60%、提取时间110 min、提取次数2次，该提取工艺稳定、可靠，可为朱日亨滴丸工业化生产提供参考依据.