右美托咪定对七氟醚麻醉的大鼠下丘脑内pCaMKⅡɑ表达的影响

王丛丛，张巧梅，沈 莉，王海青，马登明

（1. 山东省蒙阴县人民医院麻醉手术科，山东 蒙阴 276200 ；2. 陕西省空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科，陕西西安 710032）

吸入式麻醉药自问世以来已有100 多年的临床使用历史。七氟烷是目前临床上常用的一种吸入式麻醉药。右美托咪定（dexmedetomidine）是一种新研发的ɑ2 肾上腺素受体激动剂。此药的镇痛、镇静效果较强，因此在临床上迅速得到推广应用。右美托咪定对脑的保护作用在动物的脑缺血/ 再灌注模型中已得到证实[1]。Ca2+/CaM- 依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin dependent kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ）在真核细胞中普遍存在，可参与细胞内多种信号的传导，通过调控Ca2+对动物的神经系统发挥一定作用[2]。以往的研究表明，磷酸化的CaMK Ⅱ可参与全身麻醉机制[3]。在使用七氟醚进行麻醉时，右美托咪定能否通过影响磷酸化CaMK Ⅱ而参与全身麻醉机制仍不能明确[4]。下丘脑是调节人体内脏活动和内分泌活动的高级中枢，能通过多种途径对机体活动进行调节。本文主要是探讨右美托咪定对使用七氟醚进行麻醉的大鼠下丘脑内磷酸化Ca2+/CaM-依赖性蛋白激酶Ⅱα（phosphorylation of Ca2+/calmodulin dependent kinase Ⅱα，pCaMK Ⅱα）表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

20 只雄性SD 大鼠（由空军军医大学实验动物中心提供），其体重为250 g 左右。对这些大鼠进行适应性饲养1 周后开始进行实验。本实验严格遵守动物伦理学的相关规定。

1.2 材料与仪器

右美托咪定（由江苏新晨医药有限公司生产），无菌去离子水溶解，凝胶成像仪（由美国伯乐Bio-Rad 公司生产），气体浓度检测仪（由西安诺科仪器有限责任公司生产），1:2000 的CaMK Ⅱ（由上海信裕生物技术有限公司生产，批号为xy-I006081），脑电监测仪（由上海海神医疗电子仪器厂生产），自凝牙托粉和牙托水（由河南牙益美医疗器械贸易有限公司生产，批号为180917），大鼠脑立体定位仪（由上海玉研科学仪器有限公司生产）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验模型的制备 将浓度为10%的水合氯醛0.5 ml/kg注入大鼠的腹腔内，对其进行麻醉。采用大鼠脑立体定位仪定位其侧脑室的位置。将2 mL 注射器的针头打磨成1.7 cm 长的细管，在大鼠前囟后0.8 mm、脑正中线旁1.2 mm 处对其侧脑室进行穿刺，穿刺的深度为3.8 mm。穿刺成功后用自凝牙托粉和自凝牙托水固定细管。将导电针埋于大鼠的头皮下，待牙托粉凝固后用胶布固定导电针和细管[5]。

1.3.2 分组方法及给药方法 将20 只大鼠随机分为对照（control，Con）组和右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）组，每组各有大鼠10 只。经Con 组大鼠的侧脑室小管注入无菌生理盐水0.1 mL，经Dex 组大鼠的侧脑室小管注入浓度为20μg/mL 的右美托咪定0.1 mL。将脑电监测装置连在大鼠的头部，对其实施全程脑电监测。注药30 min 后将两组大鼠置于密闭的容器中，用6倍最低肺泡有效浓度（minimum alveolar concentration，MAC）的七氟烷对其进行快速麻醉诱导。待其进入麻醉状态后，用浓度为1.5% 的七氟烷对其进行维持麻醉。麻醉30 min 后停药，停药后为其吸入6 L/min 的纯氧，对其进行快速洗脱处理，直至其完全清醒。

1.3.3 大鼠脑电波的监护和记录 实验全程密切监测两组大鼠的脑电波，同时注意观察其行为变化，选择七氟烷麻醉30 min 时采集其脑电波进行分析。

1.3.4 大鼠下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 蛋白表达的测定 在麻醉30 min 时，用断头脱颈法快速处死两组大鼠，取出其脑组织。在冰上快速分离出下丘脑组织，用低温离心机对下丘脑组织进行离心处理（转速为10 000 rmp/min），保留上清液。以BCA 蛋白试剂为标准品（每例提取标本40 μg），求得标准曲线定量。用聚丙烯酰胺凝胶对上清液进行电泳后将其恒压转移至聚偏二氟乙烯膜上，并用5% 的脱脂奶粉室温封闭1 h。随后加入pCaMK Ⅱ一抗，并在3℃下封闭过夜。采用辣根过氧化酶标记的二抗将标本在室温下孵育1 h，显像后对图像进行分析，明确两组大鼠下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表达情况[6]。

1.4 统计学方法

用SPSS 20.0 软件处理本研究中的数据，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两组均数比较采用t检验，多样本均数比较采用One-way ANOVA 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠的脑电记录及波形分析

用七氟烷麻醉30 min 时，采集两组大鼠的脑电波进行分析发现，与Con 组大鼠相比，Dex 组大鼠的抑制性脑电波（δ 波）增多（P＜0.05），兴奋性脑电波（α 波、β 波）减少（P＜0.05）。详见图1。

图1 两组大鼠的脑电波频谱

2.2 两组大鼠下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表达情况

用七氟烷麻醉30 min 时，与Con 组大鼠相比，A 组大鼠下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表达量更低（P＜0.05）。与Con 组大鼠、A 组大鼠相比，B 组大鼠下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 蛋白的表达量更低（P＜0.05）。详见图2、图3。

图2 大鼠下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 蛋白的相对分子量

图3 大鼠下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 蛋白的相对表达量

3 讨论

吸入式麻醉是指挥发性麻醉药物经呼吸系统入血，抑制中枢神经系统而达到麻醉目的的一种麻醉方法。吸入式麻醉药在体内分解、代谢较少，大部分药物能以原形从肺部排出体外，具有较高的安全性、可控性[7]。近年来，七氟烷吸入式麻醉在外科手术中应用越来越广泛[8]。盐酸右美托咪定是一种高选择性ɑ2 受体激动剂，能通过激动脑干蓝斑核和脊髓背角的ɑ2 受体而产生镇静、镇痛、抗焦虑、催眠的作用。此药除了具有上述作用外，其在脑保护、抗炎等方面的作用也逐渐受到人们的关注[9-10]。生物电现象是生命活动的基本特征之一，各种生物均有电活动的表现。脑电波是脑神经细胞的电生理活动在大脑皮层或头皮表面的总体反映[11-12]。脑电波中的δ 波是麻醉状态下的典型波形，在成人极度疲劳或昏睡状态下易产生。脑电波中的α 波、β 波是成人在清醒状态下出现的脑电波[13-14]。本实验经侧脑室为大鼠注入右美托咪定后，采用七氟烷对其进行麻醉，麻醉30 min 时取其脑电波进行频谱分析，发现其抑制性脑电波δ 波明显增加，兴奋性脑电波α 波、β 波明显减少。这一结果不仅符合右美托咪定的药理特性，更从电生理学层面印证了此药的效应。本实验用七氟烷麻醉30 min 时及动物清醒状态下取大鼠的下丘脑组织进行免疫印记分析发现，Dex 组大鼠下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 的表达量在麻醉30 min时明显降低，这一指标在其完全清醒后逐渐升高并恢复正常。这一结果表明右美托咪定能在一定程度上抑制动物脑内pCaMK Ⅱɑ 的表达。现阶段，全身麻醉技术已十分成熟，但关于麻醉药物对中枢神经系统作用机制的认识仍较为局限。近年来，多种参与睡眠觉醒的中枢神经递质（如多巴胺、乙酰胆碱、γ- 氨基丁酸等）相继被证实参与了麻醉分子机制[15]。电生理、磁共振等方面的研究也发现，除了经典的大脑皮层、脑干、脊髓外，一些未受重视的中枢结构（如下丘脑）也是麻醉药的敏感区域[15-16]。

综上所述，右美托咪定可对使用七氟醚进行麻醉大鼠的脑电波产生抑制，还可抑制麻醉过程中其下丘脑内pCaMK Ⅱɑ 的表达。关于右美托咪定导致动物意识消失及意识恢复的机制，仍需要通过进一步的研究来发现、证实。