m6A-RNA甲基化在急性髓系白血病中的研究进展

全海薇，张亚丽，王 涵，邹雨彤，程美玉，姜贺然，夏 薇

(北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种由于造血干/祖细胞累积各种获得性遗传畸变，导致血细胞发生生长/分化改变的恶性克隆性疾病[1]。由于AML发病机制的复杂性、异质性，目前仍然不能在分类系统上得到完全反映，AML的发病机制、分类及诊断治疗面临着研究瓶颈[2]。近年“表观转录组学”的建立，为AML的诊治提供了新的研究方向。“表观转录组学”是在RNA水平上发现的一种新兴基因表达调控方式。在RNA的化学修饰中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰是真核生物mRNAs和lncRNA最常见的转录后修饰。在此背景下，首次在AML中发现了m6A沉积并直接参与癌症发生。m6A修饰的可逆性和动态性以及其微调和协调基因表达程序的能力，对白血病细胞分化、发育和AML的临床诊治产生巨大贡献[3]。本文综述了m6A-RNA甲基化修饰在AML中的作用，并为小分子药物靶向治疗AML提供新思路。

1 m6A-RNA甲基化概述

RNA形态功能多样性是以RNA的四个典型碱基进行大量修饰为基础。自20世纪60年代以来，已经发现了150多种RNA的化学修饰[4]。其中m6A修饰即腺苷残基的N-6位置添加甲基是真核生物最常见的转录后修饰。m6A修饰由甲基化转移酶(writers)、去甲基转移酶(erasers)、甲基化相关阅读蛋白(readers)以及可能影响这些调节的其他蛋白动态控制。m6A修饰影响mRNA剪接、核输出、稳定性和翻译等不同阶段，在基因表达中发挥关键作用[3]。

Writers包括甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like 14,METTL14)以及m6A-METTL相关复合物(MACOM)。MACOM复合物由肿瘤相关蛋白(WTAP)、RNA结合基序15(RBM15)、Vir样m6A甲基转移酶(VIRMA，也称KIAA1429)、Cbl原癌基因1(CBLL1)和锌指蛋白ZC3H13等多种蛋白质组成。在体内，METTL3-METTL14二聚体活性受MACOM调节。MACOM中的RBM15及其类似物RBM15B通过与WTAP结合，协助WTAP与METTL3-METTL14二聚体结合，招募METTL3-METTL14至核小斑对底物进行修饰[5-6]。在转录过程中，METTL3和METTL14诱导m6A沉积在内含子区域新生RNA上[7]，完成mRNA剪接。沉默METTL3可减缓mRNA核输出。

在真核细胞中，erasers包括脂肪和肥胖相关蛋白(fat-mass and obesity associated protein，FTO)和Alk B同源物5(Alk B homolog 5，ALKBH5)，二者均属于AlkBα-戊二酸依赖的双加氧酶。敲除人源细胞中FTO或ALKBH5均导致m6A水平全面上调。FTO针对多个RNA底物，对不同组织和生物系统有不同的功能。下调ALKBH5可加速mRNA的核输出[8]。

Readers包括含YTH结构域的蛋白家族、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BPs)、RNA结合蛋白以及“间接”readers。含YTH结构域的蛋白家族包括YTHDF1[9]、YTHDF2[9]、YTHDF3[9]、YTHDC1[10]和YTHDC2[11]，是一组主要的m6A readers，在mRNA稳定性[12]、mRNA剪接[13]、mRNA结构[14]、mRNA输出[15]、翻译效率[16]和miRNA生物发生[17]等方面发挥重要作用。IGF2BPs包括IGF2BP1/2/3，是一类独特的m6A readers，通过识别GG(m6A)C序列(典型的m6A序列)与目标mRNA靶向结合，提高mRNA的稳定性[18]。此外，“间接”readers HNRNPC、HNRNPG可作为优先结合m6A修饰的RNA结构“开关”。

2 m6A-RNA甲基化在AML中的作用

2.1 METTL3-METTL14复合物在AML中的作用

RNA甲基转移酶METTL3是复合物中唯一的催化亚基，METTL14在体内与METTL3连接形成稳定的二聚体，在维持复合物完整性、定位靶向mRNA方面起非催化作用[19]。AML是METTL3和METTL14表达水平最高的癌症之一，与正常造血祖细胞相比，AML细胞中METTL3和METTL14均过度表达[20-21]。METTL3-METTL14甲基化复合物能促进AML的发展并维持原始白血病细胞[20-21]。在AML细胞系和原代母细胞中过表达METTL3和METTL14均可促进增殖，下调则诱导细胞分化和凋亡[20-21]。对AML移植小鼠模型进行全基因组CRISPR/CAS9筛查，结果表明METTL3、METTL14和METTL16是影响AML生存的关键基因[21]。

在AML细胞中，METTL3和METTL14主要结合到转录起始位点，早期的m6A共转录沉积促进与AML增殖相关的mRNA的翻译，如c-MYC、BCL2、PTEN、SP1和MYB[20-21]。METTL14通过SPI1-METTL14-MYB/MYC信号轴调节骨髓生成和白血病发生[20]，髓系转录调控子SPI1负调控METTL14，使其诱导m6A修饰致癌基因MYB和MYC，从而抑制AML细胞分化、促进细胞自我更新。转录因子CEBPZ(CCAAT增强子结合蛋白)是AML中的一个新的突变基因[22]，可在基因启动子上招募METTL3[21]，提示AML中METTL3的共转录招募下降。研究表明在AML中，METTL3异位于细胞质，与负责翻译的核糖体互相作用[23]。胞质中的METTL3可以促进特定mRNA(如癌基因EGFR和TAZ)的翻译，而不依赖于METTL3自身的催化活性[23-24]。此外，较高水平的胞质METTL3导致WTAP蛋白水平随之增加[23]，维持WTAP蛋白在AML中的致癌作用。

2.2 WTAP在AML中的作用

Wilms肿瘤1(WT1)基因在白血病的发生中具有致癌作用，其过度表达与不良预后相关[25]。WTAP与WT1配对，调节静止和增殖之间的平衡。研究发现WTAP蛋白在AML中上调。下调AML细胞系中WTAP，可抑制细胞增殖，诱导凋亡，延缓白血病病程[26]。另外，WTAP在RNA代谢的表观转录调控中可作为m6A甲基转移酶复合体中的一个调节亚单位来发挥作用[27]。

2.3 RBM15在AML中的作用

部分急性巨核细胞白血病(AMKL)患者常产生染色体异位，携带融合癌基因RBM15-MKL1[28]。RBM15可直接结合并控制巨核生成基因GATA1、RUNX1、TAL1和c-MPL的pre-mRNA选择性剪接[29]。蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)在AMKL细胞系中的过表达可下调RBM15蛋白水平，影响RNA的剪切，从而阻遏巨核细胞的终末分化[29]。敲除RBM15可导致B细胞分化、髓系和巨核细胞扩张受阻[30]。靶向PRMT1可能是恢复AMKL巨核细胞分化的一种根治疗法。

2.4 FTO在AML中的作用

已有报道，在携带MLL-AF9、PML-RARA和FTL3-ITD易位的AML亚型中FTO表达升高[31]。R-2-羟基戊二酸(R-2HG)在体内、外通过抑制白血病细胞的增殖、促进细胞周期阻滞和凋亡而发挥广泛的抗白血病活性。R-2HG可通过抑制FTO高表达，靶向FTO-m6A-MYC/CEBPA信号轴，下调MYC和CEBPA表达，从而发挥抗肿瘤作用[32]。在癌细胞系中进行的大规模基因敲除筛查显示，白血病细胞不存在普遍的FTO依赖[33]，FTO在m6A修饰中的去甲基化作用还存在争议。

3 m6A-RNA甲基化作为抗癌药物靶点的研究

参与m6A-RNA甲基化的writers、erasers和readers这三类物质，目前已成为小分子靶向治疗AML的潜在靶点。主要针对METTL3-METTL14复合物探索开发新的治疗策略和小分子药物。研究人员获得了METTL3-METTL14复合物的高分辨率晶体结构，这两种蛋白都属于Ⅰ类甲基转移酶家族[34]，其中METTL3的结合口袋是由Ⅰ类甲基转移酶家族通用的折叠酶产生的。由此，为设计药物的结构提供导向：可根据晶体结构利用计算机工具CADD来设计新的抑制剂[35]；也可考虑采用已发现的针对Ⅰ类甲基转移酶家族成员的有效抑制剂，例如蛋白赖氨酸甲基转移酶、PRMTs和DNA甲基转移酶(DNMTs)来治疗AML。

METTL3-METTL14复合物催化甲基转移酶反应，是通过复合物的催化部位与腺苷蛋氨酸(SAM)或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)结合[35](如METTL3与SAM结合[34])完成的。甲基供体SAM辅因子和甲基受体腺苷底物结合在METTL3[36]的不同位点。已报道的METTL3-METT14抑制剂只有反应产物SAH和核苷酸类似物西那霉素[37]。因此，在构思潜在METTL3-METTL14抑制剂时，可以考虑以核苷酸、SAM或者双底物配体为靶点。针对核苷酸靶点的药物，如氮胞苷和地西他滨，可作用于DNMT，已批准用于AML临床治疗之中[38]，但这些药物的生物利用度差且毒性强。相比之下，与SAM结合的小分子抑制剂有良好的药理特性和口服生物利用度。目前针对混合型白血病1H3K4甲基转移酶的MM-401抑制剂[39]、针对套细胞淋巴瘤蛋白精氨酸甲基转移酶-5的EPZ015666口服抑制剂[40]、组蛋白甲基转移酶DOT1L抑制剂[41]等治疗药物已进入临床研究。双底物抑制剂与SAM和核苷酸抑制剂相比，基于结构层面而言，具有更强的选择性。科学家设计了DNMT3A和DNMT1双底物抑制剂喹唑啉-喹啉衍生物，其可诱导结肠癌HCT116细胞CDKN2A启动子去甲基化并于治疗7 d后重新激活[42]。这种思路同样适用于AML的治疗中。

随着人们对转录组学研究的逐步深入，发现RNA转录水平的改变与多种癌症密切相关，并在转移和耐药中发挥重要作用[43]。已发现AML中m6A修饰的改变可以破坏正常的细胞分化并促进癌症的发展。可以预见，m6A修饰酶的活性易被化合物靶向，并最终可能在未来的癌症治疗中提供重大创新。