外泌体在急性心肌梗死诊断及预后的应用价值

项楚涵，张甜甜，张步春

外泌体是细胞分泌的具有脂质双分子层结构的细胞外囊泡，内含DNA、RNA、代谢物、脂质、胞质和细胞表面蛋白，是细胞间通讯的重要介质[1]。近年来有关外泌体与AMI关联性的研究日益增多。本文旨在检索国内外近期已发表文献深入分析外泌体在AMI中的作用及机制，为诊断和治疗急性心肌梗死提供新的思路。

1 外泌体概述

外泌体的大小在40～160 nm，其平均直径100 nm，主要来源于细胞的内涵体(Endosome)。外泌体由细胞内的内涵体通过胞吐作用释放到胞外形成的[2]。

外泌体内包含核酸、细胞因子、蛋白质、脂类等多种物质，在细胞间的通讯中起到介质作用。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族(CD63、CD81和CD9)；热休克蛋白家族((HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)。外泌体的分离和富集是外泌体生物医学研究和临床应用分析前的必要环节。不同的分离和富集方法会影响外泌体的数量、类型和纯度。目前外泌体的提取方式主要包括以下几种：一是超速离心法，这是目前外泌体提取最常用的方法；此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足；二是过滤离心，这种操作方法不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题；三是密度梯度离心法，用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少；四是免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行后续的实验；五是PS亲和法，该方法将PS(磷脂酰丝氨酸)与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，该方法获得的外泌体可用于细胞共培养和体内注射。外泌体在心血管与代谢性疾病中都发挥重要作用。外泌体由于具有调节复杂细胞内通路的特性使其在许多疾病的治疗控制方面具有潜在的用途，可以用于免疫调节、抗原呈递和组织修复等方向的治疗。外泌体上的分子标记使其成为用于疾病诊断和预后监测的有效液体活检指标。随着对外泌体的深入了解，其临床应用越来越受到关注。

2 外泌体在急性心肌梗死中的诊断价值

高敏肌钙蛋白目前是诊断心肌梗死的标准生物标志物，但是受年龄、性别、有无胸痛发作、肾功能水平的影响，在心力衰竭、应激性心肌病、大量肺栓塞或肺动脉高压、严重急性中枢神经系统疾病等疾病，甚至剧烈运动情况下也可能升高。人们发现外泌体能够作为检测恶性肿瘤的潜在标志物[3]，而外泌体作为AMI生物标记物具有很大的诊断潜力，我们着重关注外泌体所携带的miRNAs和蛋白的诊断价值。

血清和血浆中发现的miRNAs具有稳定性、时间和组织特异性的特征，而外泌体作为miRNAs有效运载体，可能为急性心肌梗死患者的诊断提供一种新的可能。从心肌梗死患者血清中分离的外泌体包含miR-183，研究[4]证实miR-183水平与心肌缺血损伤程度为正相关，是一种新的心肌梗死诊断的生物标志物。miR-30a在急性心肌梗死患者血清的外泌体中高度富集，并通过外泌体在缺氧心肌细胞间有效转移[5]，这提示外泌体做为运载工具有很好的保护miRNAs的能力。值得关注的是外泌体来源的miRNAs也可以在尿液中检测到，急性心肌梗死大鼠外泌体相关的miR-1在血液和尿液中均出现特异性升高[6]，这提示检测尿液种的外泌体可能成为急性心肌梗死新的诊断方法，而提取尿液的无创性可能会大大提高心肌梗死的诊断率具有很好的临床应用前景。在心肌梗死的诊断、评估中不可以忽视外泌体特异性选择携带蛋白的潜在价值。心肌梗死和非心肌梗死患者的血浆外泌体行蛋白质组学分析后发现，心梗患者的血浆外泌体中有252种蛋白为显著差异表达蛋白，并证实外泌体C1QA、C5、APOD、APOC3、GP1BA、PPBP可能为一组新的心肌损伤的标志物[7]。

3 外泌体对急性心肌梗死患者预后的影响

患者急性心肌梗死后存活的心脏组织骤减，随着病情的发展会出现心脏泵血功能下降，最终可能出现充血性心力衰竭。在心肌梗死病程中，多种类型的心脏细胞会释放外泌体入血，这些外泌体参与心脏细胞的信息交流并传递有效物质，对心肌梗死患者的预后产生影响，值得注意的是miRNAs在外泌体介导反应中的重要地位。

心肌细胞来源的外泌体对于急性心肌梗死可以起到调节炎症、调节自噬、抑制细胞凋亡的作用。急性心肌梗死过程中来源于心肌细胞的外泌体的生成出现一过性增加，聚集在缺血心肌中的外泌体会被浸润的单核细胞迅速吸收，最终调节了局部的炎症反应[8]。人诱导多能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CM)在心肌梗死中的积极作用则离不开其分泌的外泌体能够促进血管内皮细胞的生成[9]，还可通过调节缺氧心肌细胞的自噬来改善心肌梗死后的心功能，为缺血性心肌病提供无细胞特异性治疗[10]。心肌细胞所分泌的miRNAs的有效转运离不开外泌体这个有效通讯介质，如miR-92a以外泌体运载的形式转移到成纤维细胞中有助于心肌成纤维细胞的激活[11]。

间充质干细胞(MSCs)因为其容易扩散分离、免疫原性低而且有转化成多谱系的潜能，成为改善心肌梗死预后方面的研究热点，而MSCs分泌的外泌体在影响心梗的预后方面也越来越被重视。不同来源的MSCs如骨髓间充质干细胞、脂肪组织来源间充质干细胞、脐带血来源间充质干细胞分泌的外泌体都有较积极的报道，比如通过促进血管形成，抑制炎症反应，减少梗死面积，改善心脏收缩和舒张能力，以减少心肌梗死带来的心肌组织缺血性的损伤。MSCs来源的外泌体在体内体外均能把M1促炎型巨噬细胞转化为M2抗炎型巨噬细胞[12]。MSCs分泌的外泌体包含miR-125b-5p可以有效调节自噬水平来保护心肌[13]，也可以抑制促凋亡靶基因，从而抑制缺氧缺糖诱导的心肌细胞凋亡[14]。

经过修饰的干细胞外泌体或经人工合成的外泌体是治疗心肌梗死的新手段，外泌体可以帮助miRNA转运入靶细胞并延长miRNs的生物半衰期，心球细胞(CDCs)、心脏祖细胞(CPCs)、肪组织来源的基质细胞(ADSCs)都可能成为新的治疗工具。CDCs是较为被认可的心脏保护以及修复的一类干细胞，心肌内注射CDCs源性干细胞外泌体在急性心肌梗死的猪模型中已经有了较好的试验成果，通过开胸心肌内注射CDCs源性干细胞外泌体，心肌梗死面积下降并维护了左室射血分数[15]。CPCs来源的外泌体直接注射到缺血心脏因为转运内源性抗凋亡miRNAs可减少急性缺血再灌注损伤[16]。研究CPCs来源外泌体转染了miR-322可以加强原外泌体的血管生成作用[17]。ADSCs分泌的外泌体经过miR-146a的修饰可通过下调早期生长反应因子1(EGR1)来减弱急性心肌梗死诱导的心肌损伤[18]。

然而外泌体对于急性心肌梗死的预后影响不是只有积极的方面，关于外泌体对急性心肌梗死不良影响的研究还不够深入全面。有研究[19]证实，心肌梗死所激活的巨噬细胞分泌的外泌体富集miR-155，并通过外泌体被转移到心脏的成纤维细胞中，抑制了心脏成纤维细胞的增值并促进了炎症。

4 存在问题与展望

外泌体具有很好的临床应用前景，缺乏被大家普遍接受的分离方法是最急需解决的问题。经典的外泌体分离方法是超速离心，其重复性高，获得的外泌体量大，但是对技术和设备的要求高且分离时间长；外泌体分离商业化试剂盒的运用增多，其需要样本量小，操作简单且时间消耗少，较易重复，但灵敏度和特异性较低。除此之外外泌体提取价格昂贵，提取后有存在杂质的风险需经过较为复杂的外泌体鉴定，总的来说缺乏较为成熟的临床应用平台。未来需要开发出高纯度、高通量、高回收率的外泌体分离方法和快速、高灵敏度、高特异性的外泌体检测技术，这将大大推动外泌体的临床应用。

敏感性与特异性是判断疾病诊断标志物是否合格的关键点，外泌体诊断急性心肌梗死需要比较外泌体生物标志物与现临床常规应用指标，需要完善的大型随机对照试验。另外随着“组学”技术的发展，应重视对于外泌体的生物内容物及表征识别的开发。外泌体对急性心肌梗死的预后作用，目前研究多倾向于外泌体可以改善预后，这提供了对急性心肌梗死新的认知层面，并一定程度上提示了未来可能更好的治疗方式。现有研究多为细胞实验或动物实验阶段，后期的研究开发还需要更多的技术理论支持。但需要关注的是外泌体的内容物包含有益成分也有有害的成分，另外细胞间的信息交换外泌体只是其中一种运行形式，需要深入研究细胞其它的分泌物。

综上所述，未来外泌体有可能成为急性心肌梗死新的诊断标志物，实现对急性心肌梗死患者的早期无创性初筛。在急性心肌梗死预后影响方面，外泌体也有许多且积极的研究成果公开发布，这都展示了外泌体很好的应用前景，可能与其稳定性好、靶向性强、有一定级联效应、没有导致畸形或导致瘤变的情况以及无伦理学问题相关。