基于酶活性的抑菌作用研究进展

邓欣彤， 胡婕妤， 刘玲丽， 朱韵琪， 周雨蝶， 陈焱婷， 王 欣， 白雪莲

（ 杭州师范大学 生命与环境科学学院， 浙江 杭州 311121）

酶（ Enzyme） 是活细胞产生的蛋白质或RNA，对其底物具有很高的特异性和催化效率。 酶是一种生物催化剂， 能使细胞内复杂的物质代谢过程有序进行， 使物质代谢适应正常的生理功能， 主导着生物的新陈代谢、 营养和能量转换等许多催化过程，与生命活动密切相关的反应大多是酶催化的反应。若由于一些原因造成酶的活性减弱， 均可导致该酶催化的反应异常， 使物质代谢紊乱， 细胞结构遭到破坏， 甚至细胞死亡。 主要对细胞壁、 细胞膜、 体内代谢、 遗传物质转录4 个过程中的部分酶类进行了概述， 探究酶在抑菌作用中受到的影响。

1 细胞壁相关酶类

真菌的生存有赖于细胞壁， 如稻瘟病菌的生长发育、 极性分生孢子的萌发、 芽管的定向生长和感染菌丝的生长， 这些都涉及到细胞壁的动态变化[1-2]。冒慧颖等人[3]研究表明， 几丁质酶基因参与尖孢镰刀菌的致病过程可影响病原菌致病力。 几丁质和葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分， 几丁质酶和葡聚糖酶可以降解致病菌细胞壁的几丁质和葡聚糖成分， 导致致病菌菌丝的分解[4-5]。 李明等人[6]根据其研究结果推测柠檬醛抑制稻瘟病菌的杀菌作用与几丁质酶密切相关， 可作为靶标酶进行杀菌作用的研究。 某些化合物可以激活β-1,3 葡聚糖酶、 几丁质酶的活性来阻止病原菌细胞壁的合成， 从而引起激活物对病原菌的防御反应或引起病原菌自噬， 最终达到病害防治的效果[7-8]。

1.1 几丁质酶

1.1.1 几丁质（降解） 酶

几丁质酶（Chitinase） 是稻瘟病菌细胞壁降解的关键酶， 能催化几丁质水解生成N- 乙酰氨基葡萄糖[9-10]。 几丁质酶可通过降解病原体内的几丁质， 破坏其细胞结构， 干扰新陈代谢， 从而达到抑菌的目的。 刘雪等人[11]研究表明， 经苯丙烯菌酮处理后的稻瘟病菌， 其几丁质酶活性增加， 可破坏稻瘟病菌细胞壁结构， 起到抑菌作用。 Li R Y 等人[12]研究表明，柠檬醛可以提高几丁质酶活性， 从而破坏稻瘟病菌细胞壁的完整性， 达到抗菌目的。 李珊等人[13]研究发现， 比基尼链霉菌HD-087 产生的脂肽可以诱导稻瘟病菌菌丝体β-1,3 葡聚糖酶和几丁质酶活性增加、几丁质基因和β-1,3 葡聚糖基因表达上调， 导致几丁质酶和β-1,3 葡聚糖酶快速积累， 导致病菌细胞壁被破坏。

1.1.2 几丁质合成酶（CHS）

几丁质是真菌细胞壁的重要成分， CHS 是几丁质生物合成中的关键酶。 几丁质的合成受到干扰或沉积， 会导致细胞壁的缺失破损， 对真菌生长繁殖造成影响。 CHS 是N- 乙酰葡糖胺（ UDP-GlcNAc）催化合成几丁质的必要酶， 在几丁质的合成中起决定性作用。 代猛等人[14]研究发现， CHS 不仅在维持细胞生长方面起着重要作用， 而且与其致病能力密切相关， 在真菌原生质体的再生方面起着非常重要的作用。 Yutani M 等人[15]研究发现反式茴香脑能通过抑制CHS 的活性起到抗真菌作用。 叶文雨等人[16]研究发现不同的几丁质合成酶基因在不同RhoGAP 基因突变体中的表达量不同， 总体趋势是上调的， 说明RhoGAP 基因家族蛋白可以通过调控几丁质合酶的表达水平来参与稻瘟病菌不同阶段细胞壁的合成。

1.2 β-1,3 葡聚糖酶

1.2.1 β- 1,3 葡聚糖（降解） 酶

β-1,3 葡聚糖酶（ β-1,3-GA） 是一类能水解以β-1,3 葡萄糖苷键连接的葡聚糖酶系， 是真菌细胞壁的主要成分之一， 可直接水解真菌菌丝上的葡聚糖，从而抑制菌丝的生长。 β-1,3 葡聚糖酶与几丁质酶都对真菌细胞壁正常发育具有重要影响， 二者通常成对研究比较。 朱华珺等人[17]研究表明， 枯草芽孢杆菌分泌的β-1,3 葡聚糖酶能抑制稻瘟病菌的生长。 陈刚等人[18]研究表明球毛壳菌可产生β-1,3 葡聚糖酶对稻瘟病菌生长抑制作用明显。

1.2.2 β- 1,3 葡聚糖合成酶

β-1,3 葡聚糖是由β-1,3 葡聚糖合成酶催化的，该合成酶主要由催化亚基Fks 和调节亚基Rho1 组成， 但也可能涉及其他蛋白质[19]。 β-1,3 葡聚糖合成酶抑制剂是一类新型抗真菌抗生素， 通过抑制葡聚糖合成酶干扰细胞壁的合成， 产生抗真菌作用。Armstrong-jamed D P 等人[20]研究表明， 在粗糙脉胞菌中， 具有抗菌特性的壳聚糖可以显著降低导致β-1,3葡聚糖合成（fks） 与延伸（gel-1） 相关基因的表达。

1.3 N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase）

N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶广泛存在于微生物中，可以协同内切、 外切几丁质酶将几丁质分解为N- 乙酰氨基葡萄糖， 其在参与自然界氮循环中的作用非常重要。 在微生物体内， NAGase 同时还具有促进生物体自溶、 形态改变和营养代谢的作用[21]。 杨萍等人[22]研究发现， 立枯丝核菌细胞壁水解物可以诱导棘孢木霉N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶活性显著增加， 对立枯丝核菌具有较强的抑制作用。

1.4 纤维素酶（Cx）

病原菌细胞壁中含有少量纤维素， 纤维素酶是水解纤维素成小分子物质的酶， 是一种包含多组分的复合酶， 各组分协同作用降解细胞壁。 杨萍等人[22]研究表明， 棘孢木霉通过分泌纤维素酶水解细胞壁中的纤维素来破坏病原菌的细胞壁。 王桂清等人[23]研究表明， 辽细辛精油对灰葡萄孢菌的纤维素酶具有抑制作用， 酶活抑制率与精油浓度呈正比， 说明对Cx 酶的抑制作用可能是辽细辛精油对灰葡萄孢菌的抑菌机制之一。

2 细胞膜合成酶类

2.1 肌醇磷酰鞘氨醇合成酶（IPC 合成酶）

鞘类磷脂是真菌细胞膜的重要组成部分， 肌醇磷酰鞘氨醇合成酶是真菌鞘类磷脂的生物合成的关键酶[24]。 鞘类磷脂生物合成途径中的IPC 合成酶是真菌所特有的， 已被证明是药物作用的理想靶标。 Tan H W 等人[25]研究表明aureobasidin 对IPC 合成酶起抑制作用， 阻止真菌鞘类磷脂生物合成。

2.2 α-1,4 去甲基化酶

麦角固醇（ 又称麦角甾醇） 作为真菌细胞膜的重要组成成分， α-1,4 去甲基化酶是细胞膜麦角固醇合成途径中的关键酶之一。 缺乏麦角甾醇会导致细胞膜结构和功能的丧失。 大多数常用的抗真菌药物都是针对麦角甾醇生物合成中必需的关键酶设计的抑制剂， 其通过竞争性地与关键酶结合， 抑制麦角甾醇合成， 使真菌的细胞膜受到破坏， 从而抑制真菌的生长繁殖。 Gamarra S 等人[26]研究发现， 唑类药物可抑制α-1,4 去甲基化酶， 阻止麦角甾醇生物合成， 对真菌细胞膜造成损伤， 增加膜通透性， 产生抗真菌作用。 甾醇合成抑制剂的主要作用机制是抑制甾醇合成过程中关键酶的活性， 如三唑酮主要的靶点为甾醇14-α 去甲基化酶CYP51， 通过抑制CYP51 酶的活性使甾醇合成前体的14-α 位不能正常去甲基化而抑制甾醇的有效合成， 进而破坏细胞膜的结构[27-28]。

3 参与体内代谢的酶类

3.1 合成代谢酶

过氧化物酶（ POD） 广泛存在于动植物及微生物中， 不仅能消除自由基， 帮助调节细胞内的氧量，还能与过氧化氢酶协同解毒细胞内的有毒物质， 防止水稻受到活性氧的侵害。 过氧化物酶的活性受到抑制， 使菌丝膜系统和菌体蛋白质对内外环境更敏感， 从而影响微生物代谢。 林志伟等人[29]研究表明，黄绿木霉菌发酵液在一定程度上可以使稻瘟病菌POD酶活性下降， 对于稻瘟病菌的呼吸影响十分显著。

谷氨酰胺合成酶（GS） 是一种参与生物体氮代谢和碳代谢的酶， 也是用于合成L- 谷氨酰胺（L-Gln） 过程中的关键酶， 现已在细菌、 真菌和植物中广泛研究了涉及谷氨酰胺代谢的基因。 杨帆等人[30]研究表明苏云金芽胞杆菌glnA 基因受glnR 的调控， 在氮源丰富的条件下， glnR 可以抑制glnA 的转录； 而在营养充足的条件下， glnR 基因缺失会导致谷氨酰胺合成酶基因glnA 的表达增加。 白婧等人[31]研究表明重组菌BJ2 有最高的GS 酶活力， 利于L-Gln 的合成， 从而最终得到高产量的L-Gln。

非核糖体肽合成酶（ NRPS） 是一种多功能酶，可以在没有核糖体参与的情况下整合短肽[32]， 合成的非核糖体多肽类次生代谢产物结构和功能具有多样性， 是活性物质的重要组成部分[33]。 在许多真菌中，如旋孢腔菌（Cochliobolus）、 镰刀菌（Fusarium） 、 葡萄灰霉菌（Botrytis） 等都富含NRPS 基因[34-35]。 稻瘟病菌中的NRPS 在病原菌适应各种环境、 干扰寄主代谢并最终导致植物细胞死亡的过程中发挥作用[36]。

3.2 分解代谢酶

过氧化氢酶（CAT） 是生物防御体系的一大关键酶， 绝大多数需氧微生物都含有CAT， 其主要作用是使过氧化氢（H2O2） 还原成水和氧气。 过氧化氢可以被还原成各种有害的自由基， 氧化细胞中的各种成分， 引起细胞病变[37]。 而CAT 可促使H2O2分解， 使之处于较低水平， 从而有效防止有毒物质在生物体内累积， 使细胞免于遭受H2O2的毒害， 可反映多种环境因子对生物生理生化过程的影响。 张晓丽[38]研究发现紫茎泽兰的其中一种挥发物Carvacrol，可以使得稻瘟病菌的CAT 酶活性降低， 解毒力下降，菌体死亡。

海藻糖酶（THL） 可以将生物体内的海藻糖水解为2 分子葡萄糖， 在真菌代谢系统中有十分重要的作用。 海藻糖存在于真菌孢子、 子实体和菌丝等营养细胞中。 真菌萌发后， 海藻糖被迅速消耗， 用于真菌的核心代谢和对特定环境刺激的应答[39]。

胰蛋白酶（ Trypsin） 是致病真菌的重要毒力因子。 真菌胞外胰蛋白酶参与真菌侵染的过程， 减缓宿主细胞的增殖、 减少宿主细胞的黏附[40]。 韩志萍等人[41]研究显示， 从放线菌中提取的leupeptin 对桔黄赛多孢菌胰蛋白酶有100%的抑制效果， 其次是从利马豆中提取的LBTI， 其抑制效果也高于95%， 其余专一抑制剂的抑制效果均大于70%。 邵彪等人[42]纯化了黑豆胰蛋白酶抑制剂并发现其对植物致病苹果轮纹病菌、 瓜果腐霉病菌和白菜黑斑病菌有明显抑制作用， 通过抑制植物病原真菌分泌的蛋白酶活性，干扰其对环境中营养物质的分解利用， 从而限制和阻碍真菌的生长。

3.3 氧化还原代谢酶

超氧化物歧化酶（SOD） 是重要的内源活性氧清除剂， 能够催化O2-转化成H2O2和O2， 保持细胞膜的结构和功能。 植物在逆境下出现的伤害或植物对逆境的抵抗能力往往与体内SOD 活性相关。 活性氧的积累， 伤害了植物的细胞膜系统， 同时也可以直接杀伤病原菌、 作为信号分子等作用参与植物抗病性的表达。 宋福强等人[43]研究表明， 用菌株B.ochroleuca 发酵产物处理的F.oxysporum.sp cucumebrium 和A.solani， 其菌丝体内超氧化物歧化酶活性明显降低， 破坏了菌丝体的生物膜， 抑制菌丝的生长而死亡。 沈凤俊等人[44]研究表明， 银杏酸使球黑孢霉细胞膜通透性变高， 菌丝体蛋白质外泄， 降低了球黑孢霉菌丝体中SOD 酶活力， 对球黑孢霉呈现抑制作用。

多酚氧化酶（PPO） 普遍存在于植物、 真菌、 昆虫的质体中， 可催化醌和单宁的合成， 醌类参与细胞壁物质的合成及代谢， 能与蛋白质等大分子物质形成聚合物， 限制病原菌的扩展。 邓勋等人[45]研究表明， 在逆境胁迫下， 前期樟子松枯梢病菌的多酚氧化酶活性呈上升趋势， 发挥对菌体的保护作用， 到了后期由于氧自由基和膜脂过氧化的加重， 使细胞透性增加， 蛋白质变性严重， 最终导致各种酶含量的降低， 造成菌体死亡。 朱琳等人[46]研究表明受抑制的致病疫霉菌丝体内PPO 酶活性显著下降。

琥珀酸脱氢酶（ SDH） 是三羧酸循环和电子传递链的关键酶。 其活性直接影响电子传递链和呼吸氧化， 在呼吸链和三羧酸循环中极其重要[47]。 同时，SDH 是细胞能量代谢的重要酶， 其活性变化可反映细胞的能量代谢情况。 李丽萍等人[48]研究发现， 紫茎泽兰的活性物质对番茄青枯菌有明显的抑制作用，抑制某些蛋白质的合成， 降低SDH 的比活力， 导致影响菌的代谢。 李冲伟等人[49]研究发现金黄壳囊孢菌菌丝体细胞的SDH 酶活受到了木霉提取物的抑制和破坏， 导致整个TCA 循环的停滞。

4 参与DNA 或RNA 转录过程的酶类

转录是遗传信息从DNA 流向RNA 的过程， 一旦转录过程受到抑制， 阻止遗传物质的合成， 导致菌体细胞死亡。 目前， 国内外对于病原菌中参与DNA 或RNA 转录过程酶类的研究较少， 基于更多相关酶活性对病原菌抑制作用有待进一步研究。

4.1 尿嘧啶磷酸核糖转移酶

尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT） 是一种嘧啶合成补救酶， 可特异性作用于尿嘧啶及其类似物， 可催化合成嘧啶核苷酸前体UMP。 基因编码UPRT 的反向筛选标记基因尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因（upp） ， 将胸腺嘧啶类似物5- 氟尿嘧啶（5-FU） 转化为5- 氟单磷酸脱氧尿嘧啶， 从而抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性并导致细胞死亡[50]。

4.2 DNA 聚合酶

DNA 聚合酶是以亲代DNA 为模板， 催化底物dNTP 分子聚合形成子代DNA 的一类酶。 孙峋等人[51]研究表明， 迷迭香酸可以改变细菌细胞膜的通透性，导致还原糖和蛋白质的渗漏， 影响细胞代谢， 并通过抑制DNA 聚合酶的活性来影响DNA 复制， 从而起到抑菌作用。

4.3 DNA 拓扑异构酶

DNA 拓扑异构酶就是调控核酸代谢的关键酶之一， 其可催化DNA 链的解旋和断裂， 完成DNA 的复制、 转录等过程。 抑制酶活性可以稳定拓扑异构酶-DNA 复合体， 从而抑制翻译和复制， 最终阻碍DNA 合成和细胞分裂， 导致细胞死亡。 喜树碱及其衍生物在体外能有效抑制新型隐球菌拓扑异构酶I 的活性， 拓扑异构酶Ⅱ抑制剂依赖于泊苷对念珠菌的抗菌活性较弱[52]。

5 结语

综上所述， 已有众多研究结果发现， 抑菌物质可通过对病原菌的几丁质酶、 β-1,3 葡聚糖酶、 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、 纤维素酶、 IPC 合成酶、 α-1,4 去甲基化酶、 过氧化物酶等酶活性的作用， 抑制病原菌的生长繁殖。 目前， 国内外研究中， 基于细胞壁相关酶（ 几丁质酶、 β-1,3 葡聚糖酶） 活性研究抑制作用的报道较多， 但其他酶类研究报道较少，有待进一步研究， 从而能更全面、 更有力地论证抑菌物质对病原菌的抑制机制。