咖啡因与光照诱导斑马鱼睡眠剥夺模型行为学研究

冉思邈，谭爱华，石和元，王 平

（湖北中医药大学老年医学研究所，湖北武汉 430065）

斑马鱼容易大规模饲养，3 个月可性成熟，雌鱼每周可产卵1 次，每次产卵约为200～300枚，受精在体外完成，透明可见，便于观察。由于斑马鱼与人类基因同源性高，可作为多种实验动物模型的斑马鱼备受科研工作者的青睐。目前斑马鱼睡眠剥夺的方式主要有光照、咖啡因、持续流动水流、感官刺激、电刺激、物理摇晃等方式［1-4］。其中持续流动水流、感官刺激和电刺激需要专用的仪器与设备，而作为诱导睡眠剥夺方便快捷方式的光照与咖啡因对实验室要求较低，运用较多。但使用光照与咖啡因进行睡眠剥夺后，两者对斑马鱼行为学影响有何差异未见报道，本研究对两种方式诱导斑马鱼睡眠剥夺模型后表型和行为学改变进行了比较。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物采用野生型AB 系斑马鱼，购自中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心，饲养于湖北中医药大学老年医学研究所斑马鱼实验室。斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行，斑马鱼幼鱼生长到5 dpf 时神经系统与器官已基本发育成熟，故本次实验采用5 dpf 的幼鱼进行。饲养条件如下：鱼房温度为（28.5±1）℃，光暗条件为14∶10 h 循环交替，养鱼水pH 值为7.0～8.0，在此期间斑马鱼可从自身卵黄囊中获取营养，无需喂食。

1.2 主要试剂及仪器

咖啡因（CAS. NO. 58-08-2），体视显微镜（PXS-1020，上海蔡康光学仪器有限公司），斑马鱼行为分析系统（Videotrack Track 3.5，法国View Point Life Sciences），96 孔板（Nest Biotech，批号：701001）。

1.3 方法

1.3.1 药 物 制 备 配 置 浓 度 为200 μ mol/L［5］的咖啡因养鱼水溶液，现配现用。

1.3.2 动物分组及造模方法 将72 尾5 dpf 斑马鱼幼鱼随机分为3 组，每组24 尾，即空白对照组、咖啡因组、光照组。造模条件：空白对照组斑马鱼正常饲养24 h，咖啡因组斑马鱼在空白对照组基础上持续暴露在咖啡因浓度为200 μmol/L 的养鱼水中24 h，光照组斑马鱼在空白对照组基础上予200 lux［6］的光照条件刺激24 h，重复3 次实验。3 组幼鱼均饲养于直径为9 cm 的培养皿中，培养皿中总溶液量均为10 mL。

1.3.3 观察指标 （1）模型评价：造模结束后用斑马鱼行为学分析系统追踪各组斑马鱼运动时间，检测时间为1 h；（2）光镜下观察各组斑马鱼表型的变化；（3）用斑马鱼行为学分析系统追踪各组斑马鱼的运动时间及距离，设置追踪参数小运动为＜4 mm/s，中运动为4～20 mm/s，大运动为＞20 mm/s，计算各组鱼的运动、静息时间以及运动距离，检测时间为1 h。

1.4 统计学处理

数据运用SPSS 22.0 统计软件分析，计量资料以（±s）表示，采用多组间单因素方差分析方法，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 咖啡因与光照诱导斑马鱼睡眠剥夺模型评价

造模结束后用斑马鱼行为学分析系统追踪斑马鱼的运动情况，3 组斑马鱼均存在大、中、小运动，其中轨迹图中黑色轨迹代表小运动，绿色轨迹代表中运动，红色轨迹代表大运动。光照组斑马鱼活动时间较空白对照组明显增多（P＜0.01），咖啡因组斑马鱼活动时间较空白对照组增多（P＜0.05），光照组与咖啡因组斑马鱼活动时间未见明显差异（P＞0.05）。具体见图1及表1。

表1 各组斑马鱼运动时间（±s）Tab 1 Activity time of zebrafish in each group（±s）

表1 各组斑马鱼运动时间（±s）Tab 1 Activity time of zebrafish in each group（±s）

注：与空白对照组相比，*P＜0.01,#P＜0.05。

运动时间（s）221.19±127.40 472.15±276.68*373.56±289.34#6.52 0.003组别空白对照组光照组咖啡因组n 24 24 24 FP

图1 各组斑马鱼运动行为轨迹Fig 1 Behavioral trajectories of zebrafish in each group

2.2 各组斑马鱼表型的比较

用光镜观察3 组斑马鱼，空白对照组斑马鱼头部色素发育较光照组和咖啡因组深（图中绿色箭头所指），光照组与咖啡因组卵黄囊出现水肿（图中红色箭头所指），具体见图2。

图2 各组斑马鱼表型图（×20）Fig 2 Phenotypic image of zebrafish in each group（×20）

2.3 各组斑马鱼静息、运动时间比较

在1 h 的行为追踪过程中，各组斑马鱼均以静息状态为主，光照组与咖啡因组斑马鱼静息时间均较空白对照组减少（P＜0.05～0.01），光照组与咖啡因组斑马鱼静息时间未见明显差异（P＞0.05）；光照组小运动时间较空白对照组与咖啡因组均明显增多（P＜0.01）；咖啡因组斑马鱼中运动时间多于空白对照组（P＜0.01）；3 组斑马鱼大运动时间未见明显差异（P＞0.05）。具体见表2。

表2 各组斑马鱼静息、运动时间对比（n=24，s，±s）Tab 2 Comparison of resting and activity time of zebrafish in each group（n=24，s，-x±s）

表2 各组斑马鱼静息、运动时间对比（n=24，s，±s）Tab 2 Comparison of resting and activity time of zebrafish in each group（n=24，s，-x±s）

注：光照组与空白对照组相比，*P＜0.01，与咖啡因组相比，△P＜0.01。咖啡因组与空白对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

大运动时间2.11±4.91 2.60±6.52 2.08±7.06 0.05 0.947 6组别空白对照组光照组咖啡因组FP静息时间3 378.81±127.40 3 127.85±276.68*3 226.45±289.34#6.52 0.002 5小运动时间101.91±43.50 264.43±179.85*△79.58±51.94 19.84 0.000 0中运动时间117.16±123.04 206.22±239.35 291.90±294.53##3.45 0.037 2

2.4 各组斑马鱼运动距离的比较

在1 h 的行为追踪过程中，3 组斑马鱼大小运动距离均未见明显差异（P＞0.05）。 具体见表3。

表3 各组斑马鱼运动距离比较（n=24，mm，±s）Tab 3 Comparison of movement distance of zebrafish in each group（n=24，mm，±s）

表3 各组斑马鱼运动距离比较（n=24，mm，±s）Tab 3 Comparison of movement distance of zebrafish in each group（n=24，mm，±s）

组别大运动距离小运动距离空白对照组光照组咖啡因组FP 29.64±10.28 30.18±10.50 7.80±2.37 1.39 0.255 6 341.25±150.52 390.38±258.29 380.48±209.35 0.37 0.695 5

3 讨论

失眠是常见的睡眠问题，以频繁而持续的入睡困难和睡眠维持困难并导致睡眠感不满意为主要表现。在成年人之间，有10%～15%的人群符合失眠的诊断标准，2006 年中国睡眠研究会在我国6 个城市的调查报告显示有57%的人群具有失眠的症状。失眠严重影响了患者的身心健康，影响了患者的生活、工作质量，甚至因为长期不能获得正常睡眠导致精神状态不佳而出现交通事故等意外，严重危及了个人和社会公共安全。有研究显示，失眠伴有明显功能损害的患者每年的财政负担约为5 010美元/人，因此长期的失眠对个人和社会均造成了严重的负担［7］。研究失眠的发病机制以及寻找行之有效的防治办法有十分重要的医学价值和社会意义。目前对于失眠的机制研究主要仍依靠动物进行，主要包括大鼠、小鼠、斑马鱼、猫、果蝇等动物。对于如何造成动物失眠，人为地进行睡眠剥夺是造成动物失眠的有效方式。而目前针对不同的动物具有不同方式进行睡眠剥夺，应激、特殊环境、药物是三大最常见的睡眠剥夺方式［8］。其中应激方式包括心理、陌生环境、创伤、水面平台、慢性不可预知应激因素；特殊环境方式则包括噪音、低氧、低压环境；药物主要包括咖啡因、对氯苯丙氨酸、酒精等。

斑马鱼作为一种新型模式生物，具有体积小、繁殖快、成本低等优势，且体外受精，胚胎透明可见，方便观察其生长发育过程，目前已经成为各个领域备受青睐的生物模型。斑马鱼生活在热带淡水中，具有明显的昼夜节律，与人类基因同源性高，斯坦福大学团队［9］对幼年斑马鱼的睡眠进行了研究，发现了其与人类慢波睡眠和快速眼动睡眠相似的慢爆发睡眠和传播波睡眠，所以选择斑马鱼作为失眠动物模型具有良好的优势。但关于斑马鱼的睡眠功能目前尚不十分明确，目前研究方法的不足制约了其睡眠研究及其理论的发展。睡眠剥夺是一种较有效的构建动物失眠模型的方法，目前关于斑马鱼的睡眠睡眠剥夺方式主要有光照、咖啡因、持续流动水流、感官刺激、电刺激、物理摇晃等方式，持续流动水流、感官刺激、电刺激均需要专业的设备，且电刺激和物理摇晃可直接伤害鱼本身。光照和咖啡因作为其中最简单易行且快捷经济的方式，在普通的实验室均能进行。

光照作为一种物理睡眠剥夺方式，能够有效的对大鼠、果蝇、斑马鱼等动物进行睡眠剥夺。持续光照或在正常睡眠时间进行光照刺激，会直接对生物体进行睡眠剥夺，其已经成为对生物体睡眠剥夺相关实验的研究方法。有研究表明，许多神经元对光照有明显的反馈作用，对持续的光照、适当的光强度和大量缺乏视网膜定位的感受野具有一定的电生理反应。光照可以引起觉醒-睡眠时相发生位移，从而引起睡眠和觉醒之间的转换，光照条件发生改变会引起生物体睡眠节律的改变，这可能是松果体中褪黑素的合成量在黑暗环境中比光照时多，而褪黑素对于夜行动物来说具有增加觉醒的作用。异常光照会影响大鼠睡眠-觉醒周期以及昼夜节律的紊乱，并会导致大鼠抑郁症和空间记忆能力下降［10］。光照周期的长短会影响小鼠背侧中缝核中5 羟色胺神经元功能，包括放电频率、对去甲肾上腺素刺激的反应及电位变化等，这些因素均与睡眠-觉醒有着密切联系［11］。果 蝇 的 光 照 环 境 为12 h 光 照12 h 黑 暗，在黑暗的12 h 中给予持续光照刺激以进行睡眠剥 夺［12，13］，成 功 建 立 失 眠 模 型。吕 冬 俊［14］对 斑马鱼进行了24 h 持续光照的睡眠剥夺，结果发现相比正常组，睡眠剥夺之后的斑马鱼记忆损伤及焦虑样行为均加重。完全睡眠剥夺24 h 后斑马鱼出现认知损害，这与人类失眠后的临床症状相符。光照可以明显地抑制斑马鱼的睡眠，当斑马鱼在生物夜晚的最后6 h 暴露于150 lux 光线下，睡眠时间减少90% 以上，将斑马鱼释放到黑暗中时，睡眠并没有出现反弹，但斑马鱼在长时间恒定150 lux 光照条件下，1～2 周内睡眠逐渐恢复［15］。说明通过运用单纯的光照诱导斑马鱼睡眠剥夺模型来研究失眠是有效且方便的。

咖啡因是腺苷受体拮抗剂，通过结合腺苷A2A受体抑制睡眠，增强觉醒。腺苷是脑内重要的抑制性神经递质，腺苷的积累是睡眠压力形成的主要原因。海湾战争期间，美国海军给予飞行员使用咖啡因片作为促醒措施。所以在实验中运用咖啡因对动物进行睡眠剥夺，能够增强动物的觉醒，有效地减少动物的睡眠时间，运用咖啡因诱导斑马鱼睡眠剥夺模型亦切实可行。

本实验结果显示光照与咖啡因均能诱导斑马鱼睡眠剥夺模型、减少头部色素沉着、导致斑马鱼幼鱼卵黄囊水肿。两者在增加斑马鱼幼鱼活动时间上未见明显差异，光镜下观察卵黄囊水肿程度及头部色素沉着亦未见明显差异，故两种造模方式在模型成功与否和对斑马鱼表型的影响并无明显差异。然而，两种方式诱导的睡眠剥夺模型在运动形式上存在差异，光照组斑马鱼以小运动为主，咖啡因组斑马鱼以中运动为主，由此造成差异的相关机制需进一步探讨。

而针对斑马鱼睡眠剥夺的方法，在科研实验中可根据实验目的而选择不同的造模方式，如在进行昼夜节律相关性失眠的研究时选用光照进行睡眠剥夺则优于咖啡因，因睡眠作为一种行为模式，表现出规律的昼夜节律变化，光暗周期被认为能够影响昼夜节律，光照信号则是最主要的授时因子，重复的光刺激是睡眠剥夺 的 一 种 方 式［16，17］，因 此，此 类 实 验 研 究 更 加倾向于光照造模，且光照对斑马鱼进行睡眠剥夺结束后未见斑马鱼有补偿性睡眠，而要探讨药物对睡眠的影响，就可选择咖啡因进行睡眠剥夺造模。光照与咖啡因两种方式诱导斑马鱼睡眠剥夺模型均有效、方便、可操作性强，从经济角度考虑，光照方式似乎比咖啡因更加有优势，减少了药品的使用，节约了实验经费。

作者贡献度说明：

冉思邈、谭爱华：负责实验的实施和论文的撰写；石和元、王平：对课题进行指导和提供经费支持。