桑属植物叶绿体PsbA基因序列与进化分析

郭亮亮 吴萌萌 郭 鹏 郑丹艳 赵卫国

(江苏科技大学蚕业研究所，江苏镇江 212018)

随着测序技术的不断发展和测序成本的降低，越来越多的植物叶绿体基因组得到解析，使人们对叶绿体基因组的了解更加深入。高等植物的叶绿体基因组属于母系遗传，基因顺序和结构具有高度保守的特性，在进化中变异缓慢[1]，是植物系统发育进化研究的重要标记[2]。近年来，已有大量的叶绿体基因组序列被广泛研究。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism SNP)，是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的多态性，具有密度较大、遗传稳定、双等位分型、自动化分型等特性，也经常被广泛应用于遗传育种、品种鉴定等领域。

在核糖体基因转录内间隔区ITS序列研究上，史全良等[3]以蒙桑为材料采用PCR产物直接测序法，测定了核糖体基因转录内间隔区ITS序列，基于此序列为桑属植物进化研究提供了一定的理论依据。2004年，赵卫国等[4]以构树为外源种用同样的方法对桑属植物9个种3个变种进行了核糖体基因转录内间隔区ITS序列的测定，试验结果表明：桑属植物是单系；蒙桑单独聚为一类亲缘关系最远，鬼桑、鸡桑(雅周桑)聚为一类，其它桑种聚为一类，白桑最进化。PsbA基因是存在于叶绿体中的保守基因，其功能与光合作用有关，在植物生命活动中起着至关重要的作用。本研究通过对比鲁桑和广东桑叶绿体全基因组序列，发现PsbA基因序列有SNP，可能存在进化序列，并用基因克隆的方法来做进化分析，以期为桑属植物系统分类提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试桑属植物材料及无花果 桑属植物8个桑种15个品系(品种)及外源种无花果共计16份材料(表1)，均采自国家种质镇江桑树圃。

1.1.2 主要试剂 氯仿(分析纯)、异丙醇(分析纯，-20 ℃预冷)、75%冰乙醇(分析纯，4 ℃预冷)、Taq酶、19-Tvector、SolutionⅠ，均购自Takara公司；植物基因组快速抽提试剂盒、DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 供试桑属植物材料及无花果

品系(品种)中文名称拉丁学名鲁牛耳桑白桑Morus alba泰国桑白桑Morus alba雅安7号华桑Morus cathayana苏湖16号鲁桑Morus multicaulis节曲鲁桑Morus multicaulis湖桑32号鲁桑Morus multicaulis伦教40号广东桑Morus atropurpurea鸡桑鸡桑Morus australis特早鲁桑Morus multicaulis黑桑黑桑Morus nigra垂枝桑垂枝桑Morus alba插桑鸡桑Morus australis保靖5号华桑Morus cathayana火桑瑞惠桑Morus mizuho育71-1鲁桑Morus multicaulis无花果无花果Ficus carica

表中供试材料均采自国家种质镇江桑树圃。

1.1.3 主要仪器设备 JY300电泳仪、F3紫外凝胶成像仪，均为Gene Company Limited(基因有限公司)产品；Mastercycler nexus GX2 PCR仪、5424r台式高速冷冻离心机、-80 ℃超低温冰箱，均为德国艾本德股份公司产品；NanoDrop One微量核酸蛋白浓度检测仪，为赛默飞世尔科技公司产品；HHS-21-4恒温水浴锅，为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 供试的16份材料总DNA的提取使用植物基因组快速抽提试剂盒提取。

1.2.2 目的基因的确定 通过利用软件DNAMAN对鲁桑和广东桑叶绿体全基因组序列(全基因组序列委托武汉贝纳科技服务有限公司完成)对比发现，PsbA基因序列存在SNP，该基因具有AT偏好特性，其功能与光合作用有关，可能存在进化序列，因此将PsbA基因确定为本试验的目的基因。

1.2.3 目的基因的克隆测序 根据目的基因设计上游引物(5′-ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGC-3′)和下游引物(5′-TTATCCATTTGTAGATGGAACTTC-3′)，然后采用PCR产物回收、连接、转化、过夜培养进行蓝白斑筛选，挑选白色菌落，进行菌液培养，并送浙江尚亚生物技术有限公司测序获得16份供试材料PsbA基因的基因序列。

1.2.4 桑属植物的聚类分析 利用Clone Manager 8.0和MEGA 6.0软件对16份材料的PsbA基因序列进行对比，做进化树进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 PsbA基因序列的扩增、纯化与测序

目的基因PsbA序列长度1 062 bp。对其设计引物，经过PCR产物纯化、连接载体、转化、过夜培养之后，挑选白色单菌落培养，然后进行菌液PCR验证筛选出阳性克隆，阳性菌液送浙江尚亚生物技术有限公司进行测序获得16份材料的PsbA基因序列，结果得出16份材料PsbA基因序列长度均在1 062 bp左右，确定为目的基因序列。

2.2 不同桑种与外源种PsbA基因序列分析

用Clone Manager 8.0软件对获得的16份材料的PsbA基因序列进行对比，发现同源性在89%～99%之间。通过对比发现，桑种各品系间的同源性都大于98%，说明供试材料即使桑种不同桑属植物内部各品种的亲源关系仍然较近。但是外源种无花果与供试桑种材料同源性较低，仅为89%。

2.3 供试材料PsbA基因序列密码子分析

我们对16份供试材料的PsbA基因序列A和T含量进行了测定，15份桑属植物A+T含量平均约为57.67%，最高的伦教40号高达58.47%，最低的插桑为57.43%，含量非常接近。但是外源种无花果A+T含量仅为49.55%，差异很大。这更加证明了桑属植物叶绿体基因组的保守性强。15份桑属植物材料平均核苷酸组成为A占27.48%、T占30.10%、C占20.83%、G占21.59%，由此可以看出该基因序列在桑属植物中具有A和T偏好特性。

2.4 桑属植物基于PsbA基因序列聚类分析

采用MEGA 6.0软件以无花果为外源种对8个桑属植物材料在内的16份材料通过最大简约法(ML)做进化树进行聚类分析，结果如图1所示。从图1可以看出，桑科的无花果和桑属植物分别单独聚为一类。在图1中显示，供试桑材料中首先伦教40号、鸡桑、特早、黑桑聚为一类，自检支持率高达62%。育71-1先与火桑、保靖5号聚为一类然后再和插桑聚为一类，自检支持率为100%。鲁牛耳桑单独聚为一类。泰国桑先和雅安7号聚为一类然后再和苏湖16号聚为一类，说明有一定的亲缘关系。

图1 桑属植物的叶绿体基组序列通过最大似然法进行的聚类情况

3 小结与讨论

本次试验对桑属植物的PsbA基因序列进行了分析，发现了供试桑属植物材料的PsbA基因同源性较高(>98%)。聚类结果也进一步证明了桑属植物为单系，这和前人的研究结果[5-9]一致。采用叶绿体PsbA基因序列来进行桑属植物的聚类分析，该方法得出的结论和汪伟等[10]采用trnL内含子序列对桑属植物系统学研究有一定的相似之处，但是也有差异。试验材料中伦教40号、鸡桑、特早、黑桑聚为一类，自检支持率高达62%，说明桑属植物品种黑桑(黑桑)、鲁桑(特早)、鸡桑(鸡桑)和广东桑的亲缘关系较近，这个结果和陈仁芳等[11]基于ITS分析桑属植物亲缘关系研究结果有相似之处，他也认为广东桑和鸡桑的亲缘关系较近；广东桑和鸡桑分在一起和刘玲等[12]采用ITS、trnL-F和rps16序列研究桑亲缘关系得出的结果有相似之处。但陈仁芳等[11]通过ITS碱基序列分析认为广东桑、鬼桑、瑞惠桑、白桑之间存在某种关系，这与我们的研究结果略有出入，我们没有得出广东桑、白桑和瑞惠桑有特别近的亲缘关系。白桑和鸡桑亲缘关系较远，在传统分类中，白桑、蒙桑、鸡桑的形态完全不同，认为亲缘关系距离较远，这也与我们本次的研究结果一致。本试验中虽然将黑桑和鲁桑(特早)聚为一类，但是自检支持率并不高仅为20%，这个结果与陈仁芳等[13]将黑桑单独聚为一类(自检支持率89%)，认为黑桑最为原始的研究结果相似。鲁牛耳桑单独聚为一类，说明本次试验选取的白桑(鲁牛耳桑)与其他品种亲缘关系较远，这个结果与汪伟等[10]基于trnL内含子对桑属植物进化研究结果相似。在我们的研究结果中，鸡桑(插桑)、华桑(保靖5号)、瑞惠桑(火桑)和鲁桑(育71-1)聚为一类，自检支持率为100%，说明亲缘关系较近，但是与陈仁芳等[11]的研究结果有差异，她的结果显示华桑、川桑、奶桑和长穗桑聚为一类。我们的研究和前人相比在研究的方法上有所不同，本次试验以叶绿体基因序列为依据，在研究桑属植物系统进化方面做了一个新的尝试。我们得出的结论并不能代表最终桑属植物分类系统，因为桑属植物叶绿体基因组并没有被完全测序，还有很多未知的基因需要进一步探讨，关于桑属植物系统学我们的研究还只是冰山一角，桑属植物系统进化还需进一步研究才能得出准确的结论，本试验研究为接下来的遗传关系研究提供了重要的试验数据。