腺相关病毒载体优化的研究进展

翟贯星（综述） 傅卫辉 徐建青 张晓燕（审校）

（复旦大学附属公共卫生临床中心 上海 201508）

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是感染人和一些其他灵长类动物的小型（20 nm）复制缺陷的非包膜病毒，属于细小病毒科（Parvoviridae）。AAV 依赖与其他病毒（主要是腺病毒）共同感染进行复制，最初在腺病毒制剂的污染物中被发现，并因此得名[1-2］。 AAV 有9 种常见血清型（AAV 1～9），还 存 在AAV10、AAV-DJ、AAV-DJ/8 等血清型。AAV 基因组包含两个开放阅读框：Rep 与Cap（图1）。AAV 病毒缺乏明显的致病性，目前尚不清楚AAV 是否会引起疾病，但会引起非常温和的免疫反应。

图1 AAV 基因组Fig 1 Viral genome of AAV

AAV 能够同时感染分裂和静止期的细胞。AAV 载体基因组可以作为附加体存在于细胞内，在各种实验环境中也观察到了载体整合。某些情况下，整合对于AAV 载体的治疗或实验效果至关重要[3］，AAV 具有在人类19 号染色体上特定位点（称为AAVS1）稳定整合到宿主细胞基因组中的能力[4-5］。AAV 稳定整合的特点使其比逆转录病毒更具可预测性。不同血清型的AAV 病毒也具有不同的组织亲和性[6］。AAV 作为基因治疗载体，通过在载体上移除Rep与Cap消除其整合能力，所需基因与启动子一起插入反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）之间，该序列有助于单链载体DNA 被宿主细胞DNA 聚合酶复合物转化为双链后在细胞核中形成串联体[7］。在未分裂细胞中，这些串联体在宿主细胞生命周期中保持完整；在分裂细胞中，游离DNA 不随宿主细胞DNA 复制，AAV 的DNA通过细胞分裂而丢失[8］。AAV 的DNA 随 机整合到基因组的发生频率很低[8］。AAV 具有非常低的免疫原性，仅限于中和抗体的产生，而不会诱导细胞毒性反应[9-11］。较低的免疫原性和感染静止细胞的能力，使AAV 非常适合作为人类基因治疗的载体。

AAV 作为载体具有广泛的应用前景，既可以用于肿瘤的治疗（如黑色素瘤）[12］，也可作为载体构建疫苗（如HIV 疫苗）[13］，还可以作为免疫治疗载体用于慢性感染疾病的治疗（如乙型肝炎）[14］。AAV 在流感预防方面也有一定的应用，AAV 介导的抗体表达能够保护老年和免疫缺陷小鼠免受流感病毒的损 伤[15］。 目前已有Glybera （AAV1）、Luxturna（AAV2）和Zolgensma（AAV9） 3 种基于野生型AAV 的基因治疗产品上市[16］。许多AAV产品已经用于临床Ⅰ期、Ⅱ期与Ⅲ期试验。其中，有Ⅰ期临床试验采用AAV2 作为载体，用正常基因替换芳香族L-胺基酸类脱羧基酶（aromatic L-amino acid decarboxylase ADCC）缺乏症患者的缺陷基因，主要靶 向 于脑部[17］。AveXis 公司用AAV9 研究 开 发的基因治疗产品SMN，主要作用于脊髓，能够治疗脊髓性肌萎缩（spinal muscular atrophy，SMA）患者，目前已经处于临床Ⅲ期阶段[17］。AAV 用于基因治疗，不仅可以替换原有缺陷基因，也可以沉默、编辑缺陷基因，还能够增加新的基因[18］。

为了实现更低、更安全的载体剂量，需要提高AAV 转导效率、逃逸中和抗体、提高细胞/组织特异性。对AAV 本身进行改造，如对衣壳蛋白进行改造，不仅可以提高AAV 的转导效率和靶向性，还能减轻体液免疫和细胞免疫，从而降低重组蛋白的免疫原性。根据不同的组织亲和性，选择不同血清型AAV，并针对某个器官组织使用特定的启动子。对AAV 应用方面的改造有添加调控元件对AAV 表达进行调控及通过AAV 作为载体进行基因编辑等。本文将对AAV 载体改造及与应用改造的研究进展进行梳理。

AVV 载体的优化策略

增强AAV 对宿主的感染效率 AAV 感染效率比逆转录病毒载体低[19］，天然存在的AAV 血清型不能很好地适应临床的需求，需进一步改造和优化。通过对AAV 的衣壳进行修饰与突变，能够筛选出感染效率高的AAV 突变体，有利于AAV 载体传 递目的基 因。2019年，Bertin 等[20］对AAV2 的衣壳进行分子工程设计，通过对衣壳进行糖基化修饰，在3 个细胞系（HeLa、Huh7 和ARPE-19）中转基因表达增加了1.3～2.5 倍，糖基化位点修饰的AAV在B 型血友病小鼠模型中，肝基因转移引起人凝血因子（F）Ⅸ水平增加2 倍，而其T/B 细胞免疫反应并未改变。在玻璃体内基因转移显示绿色荧光蛋白表达增加约2～4 倍，并增强了整个视网膜的渗透，表明通过将衣壳蛋白糖基化能够增强基因的传递，在肝和眼方面的基因治疗中具有很好的翻译潜力。Ran 等[21］也通过在rAAV-DJ 和rAAV-LK03 衣壳上对表面暴露的酪氨酸（Y）、丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）和色氨酸（W）残基进行定点诱变，产生的突变AAV 载 体rAAV-DJ-S269T、 rAAV-LK03-Y705+731F 与野生型相比，转导效率显著增强，提示定点诱变策略适用于其他非天然AAV，促进AAV 在人类基因治疗中的应用。

为检测AAV 转染效率，Hanlon 等[22］设计了一个AAV 文库构建体iTransduce，通过将AAV9 衣壳上的一个肽文库与一个Cre 盒相结合，能够灵敏地检测转基因表达。其中一种衣壳AAV-F 介导的大脑皮层转基因表达比亲代AAV9 高65 倍（星形细胞）和171 倍（神经元），这种高转导效率无性别依赖性，并且在两种小鼠品系（C57BL/6 和BALB/c）中均能持续高效转导，使其成为小鼠中枢神经系统转导中具有应用前景的衣壳载体。

降低机体对AAV 载体的免疫反应 AAV 虽然免疫原性低，但是仍会引起人体的免疫反应，40%～80% 的成人有过AAV 感染，因此可能会引起免疫排斥反应。人体中存在的针对AAV 的中和抗体构成了一项重大挑战，限制了使用重组AAV 载体进行基因治疗的临床试验，对AAV 衣壳进行突变或修饰能够有效避免中和抗体的作用。

AAV 衣壳蛋白的定向进化路径尚未明确。Pei等[23］通过定向进化的方法在活体内分离出可转导入人肝细胞并逃避中和抗体的AAV 突变体LP2-10。LP2-10 由AAV 2、6、8 和9 不同血清型的衣壳组成，VP3 亚基衍生自与AAV6 的261～272 残基进行交换的AAV8，LP2-10 既能够转导入人类肝细胞，又表现出比其他血清型更强的逃避静脉免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）和（大多数人）血清中和抗体的能力。Tse 等[24］通过结构指导的方法来进化具有可变抗原的AAV 突变体，这种策略产生了高度分散的抗原，这种抗原在天然AAV分离株中不存在，因此无法被已存在的抗体识别。Selot 等[25］通过定点诱变筛选 出AAVrh.10 S671A突变体，不仅进入细胞的能力增强，并且在体内能够迅速迁移到核周区域，进一步提高其在肝中的基因转移效率。更重要的是，突变的AAVrh.10S617A能够规避预先免疫动物的中和抗体作用（27～64倍）。开发逃避宿主中和抗体的AAV 载体系统将大大拓宽人类基因治疗应用的范围。

将AAV 衣壳进行化学修饰能够有效避免中和抗体的作用。Mével 等[26］将N-乙酰半乳糖胺配体耦联到AAV 衣壳的表面，以去唾液酸糖蛋白受体介导肝细胞的靶向递送。化学修饰的衣壳显示出与中和抗体的相互作用减少，揭示通过化学耦联AAV的方法可能降低载体免疫反应。

AAV 通过外泌体包裹的形式降低AAV 的免疫反应。 Meliani 等[27］使用外泌体相关的AAV（exosome-associated AAV，Exo-AAV）作为肝脏基因传递系统，在降低治疗性载体剂量的同时，防止机体对衣壳的体液免疫。Exo-AAV 载体可提高肝脏定向基因转移的安全性和有效性。

提高AAV 的靶向性 为了更有效地转导治疗基因和靶向特定的组织或细胞，需要对AAV 载体进行改造以提高靶向性。

AAV 定向进化能够筛选出靶向性高的AAV衣壳结构。 Davidsson 等[28］建立了BRAVE（barcoded rational AAV vector evolution）法对AAV进行优化。 通过BRAVE 方法，每个病毒颗粒在AAV 衣壳表面都具有已知功能的肽，并在包装的基因组中具有独特的分子条形码，从单代筛选的RNA表达条形码测序可以同时绘制数百种蛋白质的推定结合序列，在体内进行一次筛选就可大规模选择工程化AAV 衣壳结构。使用BRAVE 方法和基于隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）统计的聚类，展示了25 种具有精细特性的合成衣壳变体，将此类病毒设计为在体内靶向人多巴胺神经元，并沿着大脑中的相连途径运输，从而实现前所未有的治疗准确性。

AAV 启动子和血清型是决定转基因表达动态的两个关键因素。开发适合特异性细胞或组织的启动子可以实现对特定组织的靶向性。Nieuwenhuis 等[29］将4 种常用启动子[短的CMV 早期增强子/鸡β肌动蛋白（short CMV early enhancer/chicken β actin，sCAG）、人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，hCMV）、小鼠磷酸甘油酸激酶（mouse phosphoglycerate kinase，mPGK）与人类突触蛋白（human synapsin，hSYN）］分别包装进AAV1 中，然后注射到大鼠和小鼠的感觉运动皮层中以转导皮质脊髓束。带有hCMV 和sCAG 启动子的AAV1 载体在神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中具有转基因表达，mPGK 和hSYN 启动子具有最强的转基因表达，mPGK 启动子驱动了在皮质神经元和少突胶质细胞中的表达，而带有hSYN启动子的AAV 转导诱导了神经元特异性表达，包括周围神经网中的中间神经元和V 层的皮质脊髓神经元。这一研究有助于改善转基因在大脑和脊髓的传递，皮质脊髓束的优化转导有助于研究脊髓损伤。

扩展AAV 载体容量 AAV 载体容量小，目前最多只能容纳4.7 kb 外源DNA 片段，通过相关技术扩展AAV 载体容量才能携带大型基因。

由内含肽（intein）介导的蛋白质反式剪接被单细胞生物体用来重构蛋白质。Levy 等[30］报道了双AAV 系统在递送分隔的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，然后通过反式剪接内含肽对其进行重构。在小鼠大脑（未分类皮质组织高达59%）、肝脏（38%）、视网膜（38%）、心脏（20%）和骨骼肌（9%）等部位的治疗相关效率与剂量下，优化的双AAV 系统可进行体内碱基编辑。结果显示，碱基编辑可以纠正小鼠脑组织中引起C 型尼曼- 皮克病（Niemann-Pick disease，NP）的突变，修正后能延缓神经变性并延长寿命。优化的递送载体有助于将靶向点突变有效引入多个目的组织中。Tornabene 等[31］通过内含肽在小鼠、猪以及人的视网膜中进行蛋白质反式剪接和全长蛋白重构，能够重建大型治疗性蛋白质，改善了两种视网膜遗传性疾病小鼠的表型。通过内含肽介导的蛋白质反式剪接结合AAV 对视网膜进行递送，可治疗大型基因突变导致的遗传性失明。

Maddalena 等[32］设计的三AAV 系统最多能转移14 kb 的基因，首先应用于Alström 综合征（Alström syndrome type Ⅰ，ALMS1）中，因为ALMS1 基因突变会导致常染色体隐性遗传性疾病。三AAV 系统转导后的转录组学分析显示，预期的全长产物与许多异常转录产物一致，但是只有全长转录本可以在体内有效翻译。三AAV 载体转导约4% 的小鼠感光体，并显示ALMS基因的正确定位。低感光素转导水平可能证明，在ALMS 小鼠模型的视网膜中出现了适度和短暂的改善。在猪视网膜中观察到三AAV 载体的转导水平达到单AAV 载体的40%，这预示需要进一步提高三AAV 载体在视网膜中的转导效率。

优化调控AAV 载体基因表达的策略

调控AAV 载体的基因表达 基因治疗技术的广泛使用受到缺乏小型遗传开关的限制，RNA 介导的基因调节可控制转基因表达而无需其他蛋白质成分。

Zhong 等[33］设计了一种Ⅲ型锤头状核酶，以开发在哺乳动物mRNA 上高效的RNA 开关，并显示它们可以被位阻的反义寡核苷酸严格调控。变体核酶能够在体内调节AAV 传递的转基因，从而在至少43 周内对蛋白质表达进行剂量依赖性控制，最多可达223 倍。这些可逆开关在慢性肾脏病贫血基因治疗中的测试证明，寡核苷酸可调节促红细胞生成素在生理水平的表达。这种小型、模块化和高效的RNA 开关可提高安全性和功效，并拓宽基因疗法的使用范围。Remes 等[34］利用AAV 介导的RNA发夹激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）诱饵寡核苷酸（decoy oligonucleotide，dON）递送，可能有效改善小鼠主动脉同种异体移植模型中的血管病变。AP-1 dON 处理可显著降低41.5% 的移植物中的内膜-中膜比率（P＜0.05）。在处理过的主动脉移植物中，黏附分子、细胞因子的表达以及增生的平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）、基质金属蛋白酶9阳性细胞和炎性细胞浸润的数量均显著降低，证明了抗AP-1 的RNA dON 方法在动物模型中治疗同种异体血管病变的可行性、功效和特异性。 基于AAV 的方法提供了将基于核酸的治疗剂延长递送至血管壁的可能性。 侯爱生等[35］通过构建表达shRNA 的rAAV 载体，建立了一种敲减小鼠海马EAAT3 表达的动物模型，为进一步研究EAAT3 调控机制和相关分子信号通路打下研究基础。邢梦瑶 等[36］通 过rAAV9 介 导 的RNA干扰能有效抑制H9c2 细胞NF-κB p65 基因的表达，抑制p65 基因表达对H9c2 细胞活力无明显抑制，但能减少Ang Ⅱ诱导的细胞凋亡。

亮氨酸拉链（或亮氨酸剪刀[37］）是蛋白质中常见的三维结构基序，在AAV 衣壳上进行亮氨酸拉链的修饰，通过拉链结构对基因表达进行调控，翻译后将外源肽和蛋白质整合到AAV 衣壳上，同时保留载体功能。基于此，Thadani 等[38］展示了一个模块化平台，用亮氨酸拉链卷曲螺旋结合基序装饰AAV 衣壳，形成特定的非共价异二聚体。通过镍柱亲和力证明，AAV 衣壳可通过这种方法成功展示6组氨酸标记的肽。该蛋白质展示平台可以促进在AAV 表面上掺入生物部分，从而扩大载体增强和工程改造的可能性。

基因编辑技术提高AAV 载体的精准度 AAV与CRISPR-Cas 技术相结合能够对靶向部位进行精准 的 编 辑[39］。AAV 是CRISPR-Cas 的 主 要候选 载体，可用于在体内进行治疗性基因组编辑。Hanlon等[40］观察到高水平AAV 整合（高达47%）到Cas9 诱导的鼠类神经元、小鼠大脑、肌肉和耳蜗治疗相关基因中的双链断裂（double-strand break，DSB）区，小鼠脑中全基因组AAV 定位显示，除CRISPR/Cas9 目标位点外，AAV 整合并未增加。然而，基于CRISPR-Cas9 的体内肝脏基因组编辑存在功效和安全性问题[41］，Li 等[42］提出的解决方法是，通过自删除AAV-CRISPR 系统，将插入和缺失突变引入AAV 附加体，该系统显著降低金黄色葡萄球菌的Cas9 蛋白水平，同时在肝脏中实现了高目标编辑率，在预测的潜在脱靶位点均未观察到自缺失Cas9诱导RNA 脱靶，该系统高效且通用。这种自我删除的AAV-CRISPR 系统有助于实现人类肝脏基因组编辑。Zhang 等[43］在单链AAV 中包装了Cas9 核酸酶，在自互补AAV（self-complementary AAV，scAAV）中包装了CRISPR sgRNA，并将该双AAV系统送入杜氏肌营养不良症（duchenne muscular dystrophy，DMD）小鼠模型中，有效的基因组编辑所需的自互补AAV 剂量比单链AAV 低至少20 倍。王娟[44］设计的AAV-SaCas9-sgRNA，通过约3.2 kb的SaCas9 与AAV9 载体介导CRISPR-Cas9 系统，靶向肌肉生长抑制素（myostatin）基因敲除，无论在体外NIH3T3 细胞模型中，还是在小鼠模型中，都显著提高肌肉生长抑制素蛋白的表达量，从而引起肌肉性状发生明显变化。

在体外细胞实验中，AAV 与CRISPR 能够较好地实现体外编辑。Kumar 等[45］利用金黄色葡萄球菌的Cas9（SaCas9）开 发AAV，可 在 人 类 衍 生 的293FT 细胞和小鼠衍生的Neuro2A（N2A）细胞中进行体外基因组编辑，以及在小鼠脑神经元中进行体内基因组编辑，还证明了其有能力调节Dox 和Cre 重组酶在空间上的基因组编辑。这些系统的组合使AAV 介导的CRISPR-Cas9 基因组编辑能够在空间和时间上得到调节。邹定峰等[46］在体内睾丸组织中对特异性敲除的人源Wee1 基因进行编辑。

Hung 等[47］研究发现，AAV2 介导的SpCas9 与靶向YFP sgRNA 的体内递送能显著减少转基因小鼠模型视网膜的黄色荧光YFP 细胞数量。与LacZsgRNA 处理的眼睛相比，感染YFP sgRNA 的视网膜细胞中YFP 阳性细胞减少了84.0%。与未经治疗的对侧眼睛相比，AAV2 介导CRISPR-Cas 递送后，视网膜电图谱分析未发现视网膜功能发生明显改变。表明AAV 是进行CRISPR 基因编辑的良好载体。

AAV 载体的安全性隐患最近，研究人员对患有A 型血友病的9 只狗进行AAV 基因治疗，并随访长达10年。结果显示，表达犬凝血因子Ⅷ（canine factor Ⅷ，cFⅧ）的AAV8 或AAV9 载体AAV-cFⅧ能够将缺乏的凝血因子Ⅷ校正至正常水平的1.9%～11.3%。其中，2 只狗中Ⅷ活性在治疗后约4年开始逐渐增加，并没有狗显示出肿瘤或者肝功能改变的迹象。从6 只狗的肝脏样品基因组DNA 中分析了1741 个独特的AAV 整合事件，在5 只狗中发现了细胞克隆增生，其中44% 的基因整合涉及细胞生长。所有恢复的整合载体均被部分删除和/或重新排列。这些数据表明，2 只狗中cFⅧ蛋白表达的增加可能是由于携带整合载体的细胞克隆扩增所致。早在2020年1月，一项针对狗的血友病研究表明，AAV 可以轻易将其携带的基因插入到宿主DNA 中，并且插入位置靠近调控细胞生长的基因，可能诱发癌症[48］。

这些结果支持了在A 型血友病中针对肝脏的AAV 基因治疗的临床开发，同时强调了对接受AAV 载体治疗中潜在遗传毒性进行长期监测的重要性。

结语目前AAV 的研究包括蛋白替代疗法、基因编辑、基因沉默等，需要根据不同的组织和器官设计出不同的AAV 以满足不同的需求。 随着AAV 相关研究的发展，AAV 逐渐克服了基因治疗方面的挑战，例如转基因维持、安全性、宿主免疫应答和靶标疾病，越来越能够满足人们的期望[49］。AAV 载体系统具有很高的安全性，已成为越来越成多基因治疗方法的首选载体[50］。 因此，需要解决AAV 载体设计、生产平台、产品的定量和质量控制，以及AAV 可能存在的安全隐患问题，以推动AAV基因治疗进一步发展。

作者贡献声明翟贯星 文献收集，制图，论文撰写和修订。傅卫辉 论文审阅和指导。徐建青 论文写作指导。张晓燕 论文审核和修订。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。