海葵毒素Av3对德国小蠊的毒性及其作用机制

朱 庆,高 蓉

(1.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所,南京 210014;2.南京医科大学公共卫生学院卫生检验学系,南京 211166)

杀虫剂的选择性毒性是指其能够致死某种害虫，但对非靶标生物如天敌、高等动物等相对无害或对一些害虫有毒而对另一些害虫无毒。选择性毒性的机制主要有作用靶标的选择性和代谢差异的选择性。生物体内羧酸酯酶、细胞色素P450、谷胱甘肽转移酶、ABC转运蛋白、UGT葡萄糖醛酸转移酶等是生物体内重要的解毒酶系，这些解毒酶基因的数量、丰富度和代谢活性的差异是造成选择性毒性的重要因素。如拟除虫菊酯类杀虫剂在哺乳动物体内经羧酸酯酶催化的水解反应和P450催化的氧化反应两种途径快速水解拟除虫菊酯是其选择性毒性的重要机制(Kaneko,2011)。而目前高选择性杀虫剂的开发更多地关注靶标的选择性，这种选择性来源于两种情况。一是杀虫剂的作用靶标是昆虫特有的。此类杀虫剂比较典型的是调节或干扰昆虫生长发育的昆虫生长调节剂，如作用于蜕皮激素受体的蜕皮激素类似物和双酰阱类杀虫剂，作用于保幼激素受体的保幼激素类似物、昆虫几丁质合成抑制剂和昆虫几丁质酶抑制剂等(Liuetal.,2017)；二是不同物种中作用靶标对杀虫剂的敏感性不同。杀虫剂作用靶标是害虫与杀虫剂互作过程中被赋予药物效应的特定分子，通常为生命活动中具有不可或缺的生物学功能的离子通道、酶或结构蛋白。如比较昆虫和哺乳动物烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)离子通道对不同新烟碱类杀虫剂的敏感性发现，烯啶虫胺对害虫nAChRs的亲和力是对哺乳动物的3 500倍，噻虫胺与吡虫啉的选择毒力比(哺乳动物半数抑制浓度与昆虫半数抑制浓度之比)分别为1 591和605(Casida,2018)。此外，电压门控钠离子通道(简称钠通道)作为另一种重要的靶标蛋白也吸引了研究人员的大量关注(Ffrench-Constantetal.,2016)。

钠通道在神经元和兴奋性细胞动作电位的产生和传导过程中扮演着极为重要的角色(Catterall,2000)。对于哺乳动物钠通道的研究发现，哺乳动物钠通道由220～260 kD的α亚基和30～40 kD的β辅助亚基组成(Lopez-Charcasetal.,2021)。昆虫钠通道的研究相对滞后，其整体结构和氨基酸序列与哺乳动物钠通道高度相似，由一个α亚基和一个辅助亚基TipE组成(Vaisetal.,2001;Tsengetal.,2007;Wangetal.,2013,2015)。

钠通道毒素是研究电压依赖性钠离子通道门控机制的有力分子探针，因此其作用位点也一直是研究的热点之一。根据这些毒素生理活性和结合位点的不同，至少存在7类钠通道毒素，分别对应于钠通道上的7个作用位点。包括作用于钠通道位点1的河豚毒素、蛤蚌毒素和μ芋螺毒素，作用于位点2的箭蛙毒素、藜芦定和乌头碱，作用于位点3的α蝎毒素和海葵毒素，作用于位点4的β蝎毒素，作用于位点5的雪卡毒素和短裸甲藻毒素，作用于位点6的δ芋螺毒素以及作用于位点7的拟除虫菊酯类化合物(Blumenthal and Seibert,2003;Catteralletal.,2007;Lopez-Charcasetal.,2021)。其中，位点3毒素(包括α-蝎毒素、海葵毒素和蜘蛛毒素)能够延缓或阻止钠通道的失活，使通道保持在开放状态，从而使动作电位重复发放，造成猎物的痉挛(de Limaetal.,2002;Arnonetal.,2005;Groomeetal.,2011;Maetal.,2013;Clairfeuilleetal.,2019)。

在钠通道位点3毒素中，与其他毒素相比，关于Ⅲ型海葵毒素(type III sea anemone toxin,Av3)分子生物活性表面的研究极少。Av3只含有27个氨基酸，并有许多疏水方环残基，二级结构既不含α螺旋也没有β折叠(Manoleras and Norton,1994;Honma and Shiomi,2006)。已有报道显示，对小鼠腹腔注射Av3的半数有效剂量(median effective dose,ED50)大于6 μmol/kg，对丝光丽蝇Luciliasericata幼虫ED50为2.65 pmol/100 mg (Moranetal.,2007)，结果提示Av3是一个对昆虫活性高，而对哺乳动物活性非常低的具有选择性的钠通道毒素。作为常见的卫生害虫，德国小蠊Blattellagermanica可以携带多种致病细菌和病毒，从而导致痢疾、肝炎、伤寒等多种疾病的传播，也可以引起哮喘等过敏反应。因此，本研究通过丙氨酸筛选和生物活性测定试验分析Av3毒素的生物活性表面，以及借助电生理技术研究Av3毒素在德国小蠊钠通道上的关键作用位点，以期为以德国小蠊为靶标的新型杀虫剂的对靶设计提供重要信息，同时为探索钠通道结构和功能的关系提供信息和参考。

1 材料与方法

1.1 供试动物及昆虫

德国小蠊取自江苏省疾病预防控制中心消毒与媒介生物防治所，为室内人工饲养种群。在温度29±1℃、相对湿度70%、光周期12L∶12D的光照培养箱中饲养，以全价颗粒鼠料喂育。

非洲爪蟾购自中国科学院上海神经科学研究所，在光周期为12L∶12D的斑马鱼养殖系统JXZ-500D中培养，以摇蚊幼虫为食物喂养。

1.2 供试化合物和试剂

Av3野生型(Av3 wild type,Av3-WT)及其氨基酸突变体购自上海强耀生物科技有限公司，德国小蠊钠通道BgNav1-1a及辅助亚基TipE与大鼠钠通道rNav1.2a由美国密歇根州立大学董珂教授赠与。Stbl2感受态细胞购自Invitrogen公司，KpnI,BamHⅠ,EcoRⅠ,HandⅢ和PvuⅡ等酶购自TaKaRa公司，其他生化试剂均购自Sigma公司。

1.3 德国小蠊生物活性测定

1.4 德国小蠊钠通道BgNav1-1a在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

取2年龄健康非洲爪蟾的卵母细胞，经Type IA胶原酶消化后逐个分离。PvuⅡ和EcoRⅠ分别验证BgNav1-1a和辅助亚基TipE酶切图谱。NotⅠ酶线性化BgNav1-1a和TipE，T7转录试剂盒(Promega)转录BgNav1-1a和TipE并纯化。BgNav1-1a和辅助亚基TipE的cRNA按质量比1∶1显微镜下注射非洲爪蟾卵母细胞。每个细胞注射40～50 nL(Fengetal.,1995;Warmkeetal.,1997)。

1.5 毒素与钠通道突变体和嵌合体的构建

Av3-WT的一级结构由27个氨基酸组成，在这27个氨基酸中，除了对空间结构的稳定性格外重要的6个半胱氨酸(Cys)和5个参与到二级结构中转角构成的甘氨酸(Gly)保持不变之外(Manoleras and Norton,1994)，剩余氨基酸进行丙氨酸扫描(Ala-scanning)突变，共形成16个Av3突变体。目前，钠通道上毒素作用位点3主要由4个胞外环DIV/S1-S2(Loop 3,L3)，DIV/S3-S4(Loop 4,L4)，DI/S5-SS1(Loop 1,L1)和DI/SS2-S6(Loop 2,L2)构成(Wangetal.,2011)。本研究中钠通道嵌合体主要以BgNav1-1a为骨架，将其4个胞外环分别替换为对Av3不敏感的rNav1.2a上的胞外环，构建7个重组嵌合体，分别为Chimera 1(替换L1,L2,L3,L4)、Chimera 2(替换L3,L4)、Chimera 3(替换L1,L2)、Chimera 4(替换L3)、Chimera 5(替换L4)、Chimera 6(替换L1)、Chimera 7(替换L2)。Av3突变体的合成由上海强耀生物有限公司完成。基于钠通道BgNav1-1a及rNav1.2a的嵌合体及突变体由苏州金唯智生物科技有限公司构建完成。

1.6 钠电流的记录

待表达电流在1.5～2.0 μA之间开始记录。使用美国Axon公司的900A放大器和1440A数模转换器记录电流。激活程序：置钳制电位于-120 mV，给予从-100--10 mV，以5 mV递增，波宽为30 ms的去极化脉冲刺激，记录激活电流。失活程序：置钳制电位为-120 mV，先给予从-100--10 mV、时程为100 ms、5 mV递增的预刺激脉冲，然后再给予-10 mV的测试脉冲刺激，波宽为20 ms，记录通道失活电流。峰电流程序：置钳制电位为-120 mV，给予-10 mV的测试脉冲刺激，波宽为20 ms，记录通道最大开放时的峰电流值(Tanetal.,2005)。

1.7 数据分析

激活曲线拟合方程：先以方程G=I/(Vm-VNa)计算电导，其中G为峰电导，I为峰电流，Vm为膜电位，VNa为翻转电位；再以Boltzmann方程拟和：G/Gmax=1/{1+exp[(Vm-V1/2)/k]}，其中Gmax为峰电导的最大值，V1/2为半数激活电压，k激活斜率因子。失活曲线拟合方程：I/Icontrol=1/{1+exp[(Vm-V1/2)/k]}，其中Imax为峰电流的最大值，Vm为膜电位，V1/2半数失活电压，k失活斜率因子。Av3-WT及其突变体导致通道失活被抑制的比例(通道失活的抑制率)我们通过参数I20/Ipeak来表示，I20代表时间在20 ms处的电流值，本研究中毒素作用下20 ms时钠通道失活被抑制程度已处于稳定状态，Ipeak代表峰电流的大小(Gaoetal.,2014)。实验中每一组测试的细胞数n>6，实验数据以平均值±标准误表示，结果分析采用Origin8.0软件和Sigmaplot9.0软件完成；Editseq和Bioedit软件被用来对序列进行分析和翻译。应用Student氏t检验和方差分析进行统计学分析，P<0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 Av3-WT及其突变体的化学合成与杀虫活性

Av3-WT的一级结构由27个氨基酸组成，6个半胱氨酸形成3对二硫键交联形成Av3-WT的空间网状结构(图1)。通过化学合成获得的毒素突变体利用反相高效液相色谱技术和电喷雾质谱技术确定其纯度和分子量。经检测，Av3-WT及其突变体的纯度在85.81%～98.89%之间，合成后的毒素分子量与预测分子量差值在0.16～6.74之间(表1)。

表1 化学合成的Av3-WT及其氨基酸突变体的纯度和分子量Table 1 Purity and molecular weight of chemically synthesized Av3-WT and its amino acid mutants

图1 沟迎风海葵Ⅲ型海葵毒素Av3野生型(Av3-WT)氨基酸序列及二硫键Fig.1 Amino acid sequence and disulfide bonds of type III sea anemone toxin (Av3)wild type (Av3-WT) from Anemonia viridis实线代表二硫键。Solid lines represent disulfide bonds.

德国小蠊成虫经胸部侧线区域注射给予Av3-WT后10 min可陆续观察到虫体有效的翻仰，腹部抽搐无法爬行等现象，8 h后可观察到虫体的死亡。Av3-WT引起德国小蠊的击倒效应和致死效应呈现剂量依赖性，KD50和LD50分别为20.51±6.2 pmol/g和30.05±9.8 pmol/g。毒素的不同突变体对德国小蠊成虫的毒性效果变化不一，对德国小蠊成虫KD50如表2所示。其中，R1A,P5A,P12A,W13A,N16A和S23A对德国小蠊的KD50是Av3-WT的2.1～5.7倍；Y7和W8 2个位点的突变则更为显著地降低了毒素对德国小蠊成虫的毒性作用，对试虫造成半数击倒效应所需的剂量分别是Av3-WT的24.8倍和12.4倍；而Y18A毒素毒性作用的降低最为显著，在Y18A浓度达到1 nmol/g时，对德国小蠊成虫的击倒效应数不足50%，故Y18A的KD50远大于1 nmol/g(表2)。除此之外，S2A,E20A和K26A毒素毒性作用的降低并不显著，对试虫的KD50与Av3-WT接近，分别为38.8,27.3和25.1 pmol/g(表2)。其中，Q15,P19和P25 3个位点的突变则升高了毒素对试虫的毒性作用，造成击倒效应的剂量分别是Av3-WT的0.8,0.7和0.9倍(表2)。

表2 Av3-WT及其突变体对德国小蠊成虫的毒性Table 2 Toxicity of Av3-WT and its mutants to Blattella germanica adults

24 h后观察毒素的致死效应，我们发现突变体Y7A,W8A和Y18A对德国小蠊成虫的致死效应降低显著。Y7A的KD50和LD50分别为510.3±60.3 pmol/g和737.8±63.2 pmol/g，W8A的KD50和LD50分别为253.9±36.7 pmol/g和303.2±45.7 pmol/g，而Y18A的KD50和LD50则超过1 nmol/g(表2;图2)。

图2 Av3-WT及其突变体Y7A,W8A和Y18A对德国小蠊成虫的半数击倒剂量(KD50)(A)和半数致死剂量(LD50)(B)Fig.2 Median knockdown doses (KD50)(A)and median lethal doses (LD50)(B)of Av3-WT and its mutants Y7A,W8A and Y18A on Blattella germanica adultsAv3-WT:Av3野生型 Av3 wild type.下同The same below.图中数据为平均值±标准误；星号和双星号分别表示与Av3-WT差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)(Student氏t检验)。Data in the figure are mean±SE.Asterisk and double asterisk indicate significant difference (P<0.05)and extremely significant difference (P<0.01)from Av3-WT (Student’s t-test).图4 同The same for Fig.4.

2.2 Av3及其突变体对德国小蠊钠通道失活的抑制

按质量比1∶1将BgNav1-1a和TipE的cRNA注入爪蟾卵母细胞共表达24 h后记录到稳定的钠电流。经波茨曼方程拟合后得到半数激活电压和半数失活电压分别为-29.3±1.3 mV和-49.2±1.0 mV。同时，结果显示Av3-WT抑制BgNav1-1a通道失活的半数有效浓度为196.26 nmol/L(图3:A)，选取250 nmol/L(EC60)的浓度作为后续实验中检测各毒素突变体对BgNav1-1a失活的抑制效果。与加药前相比，250 nmol/L的Av3-WT显著增加了峰电流值，由1.25 μA变为2.7 μA；同时通道的失活也被显著抑制，I20/Ipeak×100%为62%(图3:B)。我们分别检测了Av3的16个丙氨酸突变体在250 nmol/L的浓度时对BgNav1-1a失活的影响。结果显示，在第1部分的生测实验中显著降低了对德国小蠊成虫毒性作用的3个突变体(Y7A,W8A和Y18A),在电生理实验中也显著降低了它们对钠通道BgNav1-1a失活的抑制(图4:A-C)，Y7A,W8A和Y18A的I20/Ipeak×100%分别12%,23%和8%(图4:F)；S23A和P25A显著增加了毒素对BgNav1-1a失活的抑制(图4:D,E)，通道失活的抑制率分别为88.3%和100%。而在生测实验中，这2个位点突变后毒素的毒性变化并不大(表2)。除此之外，其他突变体对通道失活的抑制效果和Av3-WT相比差别不大，R1A,P5A,P12A,W13A,N16A抑制BgNav1-1a失活的通道数占总通道数的比例分别为50%,46%,39%,45%和60%(图4:F)。

图3 Av3-WT对德国小蠊钠通道BgNav1-1a 失活的抑制Fig.3 Inhibition of Av3-WT on the inactivation of sodium channel BgNav1-1a of Blattella germanicaControl:注射生理盐水的对照组Injection of physiological saline as the control group.图4-6同。The same for Figs.4-6.A:Av3-WT对德国小蠊钠通道 BgNav1-1a失活抑制的剂量依赖曲线Dose dependent curve of inactivation inhibition effect of Av3-WT on BgNav1-1a;B:250 nmol/L Av3-WT作用下德国小蠊钠通道 BgNav1-1a电流曲线Current traces of BgNav1-1a with or without 250 nmol/L Av3-WT.I20/Ipeak (%)：通道失活的抑制率 (%)Inhibition rate (%)of channel inactivation.

图4 Av3突变体对德国小蠊钠通道 BgNav1-1a 失活的抑制Fig.4 Inhibition of Av3 mutants on the inactivation of sodium channel BgNav1-1a of Blattella germanicaA:250 nmol/L Y7A对德国小蠊钠通道BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L Y7A on BgNav1-1a inactivation;B:250 nmol/L W8A对德国小蠊钠通道 BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L W8A on BgNav1-1a inactivation;C:250 nmol/L的Y18A对德国小蠊钠通道 BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L Y18A on BgNav1-1a inactivation;D:250 nmol/L S23A对德国小蠊钠通道 BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L S23A on BgNav1-1a inactivation;E:250 nmol/L P25A对德国小蠊钠通道 BgNav1-1a失活的抑制Inhibition of 250 nmol/L P25A on BgNav1-1a inactivation;F:Av3突变体对德国小蠊钠通道 BgNav1-1a失活的抑制情况Inhibition of Av3 mutants on BgNav1-1a inactivation.

2.3 德国小蠊钠通道上影响Av3-WT选择性毒性的关键位点

经双电极电压钳技术检测，在1 μmol/L Av3-WT的作用下，Chimera 1通道的失活未受到抑制(图5:A)。因此，我们推断，BgNav1-1a DI和DIV上4个胞外环的替换移除了Av3-WT在BgNav1-1a上的结合位点。为了进一步明确4个胞外环中哪个或者哪几个参与Av3-WT与BgNav1-1a的结合，我们分别检测了替换DI或DIV上2个胞外环的嵌合体Chimera 3和Chimera 2对Av3-WT的敏感性。其中，Chimera 2对250 nmol/L的Av3-WT敏感，毒素作用下63%的通道的失活受到抑制(图5:B)，而Chimera 3则对Av3-WT不敏感，通道的失活几乎不被抑制(图5:C)。为了进一步确定DI上L1和L2 2个胞外环对Av3-WT与BgNav1-1a结合的作用，分别检测了Chimera 6(替换L1)和Chimera 7(替换L2)对Av3-WT的敏感性。结果显示，67%的Chimera 6通道在Av3-WT的作用下，失活被抑制(图5:D)，而在1 μmol/L的Av3-WT作用下，仅3.6%的Chimera 7的失活被抑制(图5:E)。

图5 Av3-WT对以BgNav1-1a为骨架替换rNav1.2a胞外环的重组嵌合体通道失活的抑制Fig.5 Inhibition of Av3-WT on inactivation of recombinant chimeric channels bearing extracellular loops of rNav1.2a in BgNav1-1aA:1 μmol/L的Av3-WT对嵌合体1(替换L1,L2,L3和L4)的作用Action of 1 μmol/L Av3-WT on chimera 1 (L1,L2,L3 and L4 replaced);B:250 nmol/L的Av3-WT对嵌合体2(替换L3和L4)的作用Action of 250 nmol/L Av3-WT on chimera 2 (L3 and L4 replaced);C:1 μmol/L的Av3-WT 对嵌合体3(替换L1和L2)的作用Action of 1 μmol/L Av3-WT on chimera 3 (L1 and L2 replaced);D:250 nmol/L的Av3-WT对嵌合体6(替换L1)的作用Action of 250 nmol/L Av3-WT on chimera 6 (L1 replaced);E:1 μmol/L的Av3-WT 对嵌合体7(替换L2)的作用Action of 1 μmol/L Av3-WT on chimera 7 (L2 replaced).

通过对BgNav1-1a与rNav1.2a胞外环DI/SS2-S6序列比对(图6:A)，发现两个通道在这一片段上的氨基酸序列相差并不大，利用定点突变技术将BgNav1-1a通道DI/SS2-S6上的Val396,Ser399,Pro402,Trp403和His404分别替代为rNav1.2a上所对应的Thr,Ala,Lys,Thr和Tyr。突变体V396T,S399A,P402K和W403T几乎不影响Av3-WT对通道失活的抑制，而H404Y则显著的降低了Av3-WT对通道失活的抑制作用，1 μmol/L Av3-WT作用下失活被抑制的通道比例仅为6%(图6:B-F)。

图6 DI/SS2-S6上氨基酸替代对Av3-WT抑制BgNav1-1a失活的影响Fig.6 Effect of amino acid substitution on DI/SS2-S6 on the inhibition of Av3-WT on BgNav1-1a inactivationA:BgNav1-1a与rNav1.2a上胞外环DI/SS2-S6氨基酸序列比对Amino acid sequence alignment of DI/SS2-S6 in BgNav1-1a and rNav1.2a;B:Av3-WT对突变体V396T的作用Action of Av3-WT on mutant V396T;C:Av3-WT对突变体S399A的作用Action of Av3-WT on mutant S399A;D:Av3-WT对突变体P402K的作用Action of Av3-WT on mutant P402K;E:Av3-WT对突变体W403T的作用Action of Av3-WT on mutant W403T;F:Av3-WT对突变体H404Y的作用Action of Av3-WT on mutant H404Y.

3 讨论

天然产物是寻找对靶标生物具有特异活性物质的巨大宝库。如从蝎毒、蛇毒、芋螺毒素中分离得到的抗昆虫毒素和抗哺乳动物毒素一直是这一领域研究的热点，研究结果可以为疾病治疗药物和新型杀虫剂的研制提供重要信息(Smithetal.,2013;Chatterjee,2018;Senji Laxmeetal.,2019)。Ⅲ型海葵毒素Av3较小的分子量(27个氨基酸)以及其独特的空间构型吸引了我们的注意(Madioetal.,2019)。本研究利用化学合成的方法构建了沟迎风海葵的Ⅲ型海葵毒素野生型Av3-WT及其16个突变体(表1)。在Av3-WT及其突变体对德国小蠊的毒性试验中，我们发现Av3-WT对德国小蠊成虫具有较强的击倒效应，而突变体R1A,P5A,Y7A,W8A,P12A,W13A,N16A,Y18A和S23A与Av3-WT相比都显示出了对德国小蠊成虫毒性作用的显著降低(表2)。由于Av3分子二级结构没有α螺旋和β折叠，只有转角(Madioetal.,2019)，个别位点的突变极有可能引起Av3分子空间结构摄动，而这种摄动会影响到Av3与通道的亲和性，从而影响到多肽毒素的作用。所以我们在后续的实验中将会利用圆二色谱和傅立叶红外光谱技术分析以上位点的突变是否导致了空间结构的摄动。

在本研究中，为进一步明确Av3分子与靶标蛋白互作的生物活性表面，我们利用双电极电压钳技术来检测毒素对其受体德国小蠊钠通道BgNav1-1a的作用，结合生物活性测定试验分析构成Av3分子生物活性表面的关键氨基酸。在德国小蠊生物活性测定试验中展示出改变毒素毒性作用的突变体R1A,P5A,Y7A,W8A,P12A,W13A,N16A,Y18A和S23A抑制BgNav1-1a失活的通道数占总通道数的比例分别为50%,46%,12%,23%,39%,45%,60%,8%和88.3%。我们发现，这些多肽毒素突变体中，Y7A,W8A和Y18A这3个突变体除了在生物活性测定试验中显著降低了毒素对试虫的毒性作用(图2)，也极大地降低了对BgNav1-1a失活的抑制(图4)。这表明，Y7,W8和Y18这3个位点的突变影响了通道对毒素的敏感性，使得毒素对通道失活的抑制作用不够显著，从而降低了德国小蠊体内动作电位点火的频率，也就降低了毒素对德国小蠊成虫的神经兴奋毒性。Dalia Gordon和Michael Gurevitz团队的生物活性测定研究发现Av3上Y7,P12,W13和Y18 4个位点的突变显著降低了毒素对丽蝇幼虫的毒性作用(Moranetal.,2007)，与本研究结果相似，差异之处可能是源于不同靶标试虫体内毒素受体的结构差异。我们推断Tyr7,Trp8和Tyr18这3个位点上的芳香族氨基酸参与构成了Av3分子对德国小蠊钠通道作用的生物活性表面。同为钠通道位点3毒素的Ⅱ型海葵毒素Av2和α蝎毒素的生物活性表面与Av3相比，差异较大。Av2分子的生物活性表面不包含芳香族氨基酸(Moranetal.,2006;Kalinaetal.,2020),α蝎毒素LqhαIT的生物活性表面更大，分为两个主要氨基酸簇(Bosmans and Tytgat,2007;Gordon,2007;Chen and Chung,2012)。3类生物活性表面结构差异较大的毒素同时可与钠通道位点3作用，发挥抑制通道失活的特性，暗示钠通道位点3涵盖了通道上较广的区域(Clairfeuilleetal.,2019)。另外，对德国小蠊成虫毒性作用变化并不算显著的两个突变体S23A和P25A在电生理实验中显著增加了多肽毒素对通道失活的抑制作用。两者抑制通道数目占总通道数目的比例分别为88%和100%。同一种多肽毒素在蛋白水平实验和动物在体实验中表现出作用效果的差异，来源于活体动物对不同多肽毒素的消化和代谢。这一结果的发现表明S23和P25这2个位点上的氨基酸以某种方式参与到干扰和阻碍Av3与德国小蠊钠通道BgNav1-1a的相互作用。同时，给我们提供了通过“毒素工程”理论进一步改造和提高Av3毒性的思路和建议，也证实了在自然界中所获得的多肽可以进一步改进其潜在杀虫活性的可行性(Yanetal.,2014;Sinha and Shukla,2019)。

基于德国小蠊钠通道BgNav1-1a和大鼠钠通道亚型rNav1.2a构建的重组嵌合体与电生理试验结果表明以rNav1.2a上的DI/SS2-S6替换BgNav1-1a上对应的胞外环后所得的嵌合体通道对Av3的敏感性显著降低(图6)。原本我们想通过反向替换，将BgNav1-1a上的DI/SS2-S6替换到rNav1.2a上，以观察构成的嵌合体是否可以改变rNav1.2a对Av3的不敏感性，但此嵌合体在爪蟾卵母细胞中的表达并不成功，没有检测到电流亦或电流值很低不足以被观察到。而DI/SS2-S6上氨基酸H404突变后显著降低了BgNav1-1a对毒素的敏感性，更进一步确定了Av3在德国小蠊钠通道上选择性毒性的关键位点。序列比对发现，在节肢动物门中，昆虫、螨虫和甲壳纲类生物在对应BgNav1-1a上的His404位点较为保守(Gur Barzilaietal.,2014)，基本都是组氨酸(His)，而脊椎动物亚门钠通道对应的位点多为酪氨酸(Tyr)。我们相信，正是这个差异使得节肢动物门生物对Av3毒素更敏感(Béressetal.,1975;Schweitzetal.,1981;Moranetal.,2007;Yanetal.,2014;Niklasetal.,2021)，而包括哺乳动物、蛙、鱼在内的脊椎动物亚门生物则对Av3不敏感(Erxlebenetal.,1984;Moranetal.,2007;Frazãoetal.,2012)。这也为我们在以后研究脊椎动物安全的多肽杀虫剂提供了参考和借鉴。

致谢本研究感谢美国密歇根州立大学董珂教授提供的钠通道BgNav1-1a和rNav1.2a质粒以及南京农业大学植物保护学院高聪芬教授提供的仪器使用指导。