传染性造血器官坏死病疫苗的研究进展

陈桂花，卢彤岩，赵景壮，林婧楠，任广明，徐黎明

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

传染性造血器官坏死病（Infectious hematopoietic necrosis,IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）引起的一种导致鲑科幼鱼高死亡率的病毒病[1,2]，死亡率可高达100%。世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）将此病列为必须申报的动物疫病，我国将此病列为二类疫病[3]。IHNV 属弹状病毒科Rhabdoviridae，诺拉弹状病毒属Novirhabdovirus，基因组为单股负链RNA，全长约11 kb，依次编码六种蛋白，分别为核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N）、磷酸蛋白（Phosphoprotein，P）、基质蛋白（Matrix protein，M）、糖蛋白（Glycoprotein，G）、非结构蛋白（Nonvirion protein，NV）和RNA 聚合酶蛋白（RNAdependent RNA polymerase protein，L）[4]。该病首次于20 世纪50 年代在美国暴发，80 年代传入中国，现已广泛分布于全球许多国家，对鲑鳟养殖业造成了巨大的经济损失和威胁[5]。目前仅加拿大有IHN 疫苗上市，其他国家仍无疫苗可用。因此研发一种安全、高效的疫苗对预防该病尤为重要。

迄今为止，已报道的IHN 疫苗主要有灭活疫苗[6]、减毒活疫苗[7]和重组疫苗，其中重组疫苗包括亚单位疫苗[8]、合成肽疫苗[9]及核酸疫苗[10]。本文通过概述不同类型IHN 疫苗的研究现状，以期为水产动物疾病疫苗研发提供参考。

1 灭活疫苗

IHN 灭活疫苗是指将细胞培养获得的IHNV，经物理或化学方法灭活制成的疫苗。目前，已研究的IHNV 物理灭活方法为高温加热法。Anderson等[6]将100℃和50℃下灭活的IHNV 注射免疫虹鳟Oncorhynchus mykiss 后，能引起虹鳟产生免疫应答，但攻毒后免疫保护力低。IHNV 化学灭活方法常用甲醛、β-丙内酯（C3H4O2，BPL）和二元乙烯亚胺（BEI）等灭活剂灭活。甲醛价格低廉易获得，是最早用于灭活IHNV 的灭活剂。甲醛在灭活病毒时不仅能与含氨基的核苷酸结合破坏病毒核酸结构，还能与病毒蛋白质的氨基结合使其变性[11]。灭活温度对甲醛灭活IHNV 的灭活时间和免疫保护效果均有影响，随着灭活温度的升高，灭活时间缩短，免疫保护效果更有效。如Nishimura 等[12]以0.2%甲醛在4℃灭活IHNV 6 d，免疫虹鳟后保护率为20%～30%；Tang 等[13]和高欣等[14]用0.2%的甲醛分别在25℃和37℃灭活24 h，免疫虹鳟后相对保护率分别为79.1%和85%。相对于甲醛，BPL 和BEI 在灭活病毒时主要作用于病毒的核酸碱基，故病毒蛋白质不被破坏，不损坏病毒的免疫原性[15]。近年来，BPL 被广泛应用于IHN 灭活疫苗的研制中。BPL 浓度影响BPL 灭活IHNV 的免疫效果。魏文燕等[16]分别用0.08%BPL、0.09%BPL 和0.1%BPL 灭活IHNV 免疫虹鳟后，BPL 终浓度为0.1%时相对保护率为68%，免疫效果最佳。Anderson 等[6]和Tang 等[13]分别用2.7 mmol/L 和0.01%BPL 灭活IHNV 24 h 后免疫虹鳟，相对保护率均高于90%，且免疫保护性可持续56 d。迄今为止，关于BEI 灭活IHNV 的研究较少，仅有Anderson 等[6]和Tang 等[13]分别在0.02%BEI 32℃48 h 和1.5 mmol/LBEI 37℃48 h 的灭活条件下灭活IHNV，免疫虹鳟后相对保护率为83.33%和80%。综上可见，这三种灭活剂灭活IHNV 时，BPL灭活苗的免疫效果较好，免疫保护率较高。

2 减毒活疫苗

IHN 减毒活疫苗指用IHNV 毒力减弱的毒株制成的一类可诱导鱼体产生细胞免疫抵抗外源IHNV感染的疫苗[17]。目前，IHNV 减毒株主要通过细胞连续传代培养、应用单克隆抗体筛选和基因重组构建等方法获得。如Tebbit 等[7]、Sandra 等[18]和Ristow等[19]通过连续细胞传代分离纯化获得IHNV 弱毒株，用其免疫虹鳟均能抵抗IHNV 的感染，免疫后120 d 仍对鱼体具有保护作用，且血清中和抗体效价最大值可达1280。Roberti 等[20]利用IHNV 的中和性单克隆抗体分离筛选出两株弱毒突变体RB-1 和193-110-4，免疫虹鳟14 d 后用同源野生毒株攻毒，相对保护率为12%～65%。随着分子免疫学与基因工程技术的迅猛发展，利用基因重组技术研发出了新型减毒活疫苗[21]。Romero 等[22]应用反向遗传学方法获得重组减毒株rIHNV-Gvhsv-GFP，可同时诱导产生抗IHNV 和病毒性出血性败血症病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV）的保护性反应。Rouxel 等[23]通过调整IHNV N 基因和G 基因在整个基因组的次序构建了8 个重组减毒株，仅有N2G3、N2G4、N3G4 和N4G1 的毒力明显减弱，其中用N2G3 免疫虹鳟后可诱导产生高水平抗体，相对保护率可达86%。吴洋等[24]应用反向遗传学技术对IHNV NV 蛋白的第32～35 位氨基酸进行重组，拯救出两种减毒株rIHNV-NVQ32-35 和rIHNV-NVT32-35，其复制能力均低于野生型毒株，免疫虹鳟后，累计死亡率分别为60%和55%。Chen 等[25,26]利用IHNV G 基因和载体（pBlueScript II-IHNV-HLJ-09）成功构建了重组二价IHNV 减毒株（rIHNV-N438AΔNV-VP2），免疫虹鳟后能抵抗同源IHNV 毒株和sp 血清型IPNV 毒株的感染，相对保护率分别为84.6%和88.9%。

传统IHN 减毒疫苗和新型IHN 疫苗均具有减毒活疫苗的特点，即拥有较好的免疫原性、免疫周期长和恢复原始毒力的潜在可能[27]。相较于传统IHN 减毒疫苗，新型减毒疫苗制备周期短且在自然条件下毒力稳定，故近年来，随着对IHN 预防的不断深入，发现了一个新的研究热点：应用反向遗传学的方法重组构建IHNV 减毒株，促进了减毒疫苗向多价减毒疫苗发展。

3 重组疫苗

3.1 亚单位疫苗

IHN 亚单位疫苗指将IHNV 的抗原基因在不同表达系统中表达所获得的特定蛋白质制成的疫苗[28]。Engelking 等[29]用一种野生型IHNV 毒株RB1 的G蛋白免疫虹鳟，可抵抗同源性或异源性IHNV 毒株的感染。Oberg 等[30]利用大肠杆菌E.coli 表达含有IHNV N 蛋白的trpE 融合蛋白免疫虹鳟后，无法诱导机体产生免疫保护反应。将该融合蛋白与含G 蛋白的细菌裂解液共同免疫虹鳟时，免疫保护反应明显增强，证明了IHNV G 蛋白可诱导鱼体产生免疫保护反应。此后，关于IHN 亚单位疫苗的研究多以表达G 蛋白为基础，利用不同的表达载体制备IHN亚单位疫苗。Cain 等[31]利用昆虫细胞SF9 表达的重组IHNV G 蛋白，可诱导虹鳟产生低水平的中和抗体，在一段时间内保护虹鳟免受IHNV 的感染。Simon 等[8]用新月柄杆菌Caulobacter crescentus 表达的含IHNV 截短G 蛋白的融合蛋白，免疫虹鳟后相对免疫保护率可达26%～34%。Verjan 等[32]利用大肠杆菌表达获得了可溶性重组IHNV G 蛋白，该蛋白可诱导虹鳟产生以IFNs 介导的先天性免疫反应，相对保护率为70%。Zhao[33]等利用酵母表面展示技术成功地将IHNV G 蛋白展示在酿酒细胞表面制成口服疫苗，诱导鱼体产生粘膜免疫反应，相关免疫因子表达上调，相对保护率为45.8%。代静等[34]成功获得了一种携带有IHNV G 基因的转基因莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii，灌胃免疫小鼠后，可刺激小鼠体内的CD4+、CD8+T 淋巴细胞增加，以期通过后期进一步研究制成一种安全、有效的口服疫苗。

目前，已报道的用于IHN 亚单位疫苗生产的表达系统有大肠杆菌、昆虫细胞SF9、新月柄杆菌、酿酒酵母细胞等。用它们表达的重组G 蛋白免疫后，均能诱导虹鳟产生免疫保护性反应，但保护效果偏低。未来可通过添加适当的佐剂来增强其免疫原性，以达到更优的免疫效果。

3.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗指将具有免疫保护力的人工合成肽与适当的载体结合后，加入佐剂制成的疫苗[21]。目前，关于IHN 合成肽疫苗的研究较少。Emmenegger 等[9]根据IHNV G 基因的核苷酸序列合成了三种肽（P27、P226 和P268），将其分别与BSA 和MAP8载体偶联制成六种合成肽疫苗，免疫虹鳟后，均能识别IHNV，但识别率低，仅用P286+MAP8 免疫后血清具有中和IHNV 的作用。研究表明：肽段与IHNV 的重新编码率较低，仅有少量的抗体结合。迄今为止，IHN 合成肽疫苗仍处于实验研究阶段，需进一步探讨其免疫机制和构建机理。

3.3 DNA 疫苗

G 基因是IHNV 的主要抗原表位基因，能诱导机体产生中和抗体，刺激细胞免疫应答，能有效免疫保护鲑鳟鱼[35,36]。目前IHN DNA 疫苗主要通过将IHNV G 基因导入不同载体构建成重组质粒。根据具有的抗原基因种类，IHN DNA 疫苗可分为单价DNA 疫苗和多价DNA 疫苗。

3.3.1 单价DNA 疫苗

近些年，IHNV DNA 疫苗研究已取得了突破性的进展，根据其免疫接种方式可分为注射疫苗和口服疫苗。

注射疫苗：1996 年，Anderson 等[37]首次构建了以CMV 为启动子的IHNV DNA 疫苗。Corbeil 等[35]利用IHNV WRAC 株的G 基因构建了pIHNVw-G疫苗。从1999 年开始，在此基础上进行了大量研究。LaPatra 等[38]和Purcell 等[39]研究发现，用低剂量的DNA 疫苗可保护体质量2～160 g 的虹鳟免受IHNV 的危害。Kurath 等[40]研究发现，用该疫苗免疫虹鳟3 个月仍能在血清中检测到中和性抗体，且免疫保护率高达100%。Corbeil 等[41]发现，肌肉注射和皮内基因枪注射免疫虹鳟的保护效果明显优于浸泡和口服等免疫方式。2005 年加拿大批准该疫苗商品化，成为第一个上市的IHN DNA 疫苗[42]。2011 年Peñaranda 等[43]分别用U、M基因型IHNV 毒株的G基因构建成DNA 疫苗（PM、PU），免疫虹鳟后均能抵抗这两种基因型毒株的交叉感染和单独感染。随着对IHN DNA 疫苗的广泛研究，其引发的潜在安全性问题也备受关注，并进行了相应改良的研究。Alonso 等[44]于2003 年首次构建了含虹鳟自身干扰素调节因子1A（IRF1A）启动子的特殊表达载体（pIRF1A-G），用其免疫虹鳟后较pCMV-G 更安全。随后，Alonso 等[45]将可诱导宿主细胞程序性死亡的M 基因[43,44]分别克隆到pIRF1A-G 和pCMV-G 质粒上构建成新型自杀性DNA 疫苗。该类疫苗的独特性是具有IRF1A 和MT 2 个启动子，其中MT 可诱导M基因的表达，使含DNA 疫苗的细胞调亡，消除残留的疫苗。这些研究消除了消费者对使用疫苗后的鱼体的担忧，同时开启了核酸疫苗的安全性的新思路。

近年来，我国对IHN DNA 疫苗也进行了大量研究。徐黎明等[10]于2017 年将中国流行株的G 基因连接到优化后的pcDNA3.1 真核表达载体构建成DNA 疫苗（pIHNch-G）[46]，免疫60 d 后仍能产生保护反应，相对保护率可达90%以上。李渊等[47,48]在此基础上对该疫苗免疫的虹鳟和养殖水环境进行长期监测，结果表明：该疫苗对鱼体和养殖环境安全。何琦瑶等[49]于2019 年在真核表达载体pVAX1 上构建了IHN 核酸疫苗（pVAX1-G）。用该疫苗注射免疫虹鳟21 d 后谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）活性等血清生化指标与对照组明显不同，表明该疫苗可减轻IHNV 对虹鳟的肝脏、肾脏和肌肉组织的损坏程度，免疫保护率可达78%。

口服疫苗：口服免疫方便、不受鱼体大小的限制且免疫后鱼体应激反应小[50]，近年来，IHN 口服疫苗越来越热门。目前，已报道的IHN 口服疫苗的来源有PLGA、藻酸盐微球。Adomako 等[51]将质粒pCDNA-G 和PLGA 混合制成纳米颗粒（PLGA-PCDNA-G），投喂虹鳟后，第96 h 时即可在鱼后肠上皮细胞中检测到这种纳米颗粒，相对保护率为11%～22%。Ballesteros[52]等将pIRF1A-G DNA 质粒包埋于藻酸盐微球中制成口服疫苗，高剂量投喂虹鳟，在免疫30 d 后的相对保护率为56%。

3.3.2 多价DNA 疫苗

Einer-Jensen 等[53]研究发现：对虹鳟同时注射免疫VHSV 和IHNV DNA 疫苗，接种后可抵抗单一病毒感染和两种病毒联合感染，这一发现开启了IHN 多价DNA 疫苗研究的新章程。随着生物学技术的发展，Xu 等[54]于2017 年成功构建了抗IHN 和传染性胰脏坏死病（infectious pancreatic necrosis,IPN）的二价核酸疫苗（pCh-IHN/IPN）。用1.0 μg 该疫苗肌肉注射免疫虹鳟可抵抗高毒力IHNV 毒株的感染（RPS＞90%），明显降低头肾中IPNV 的病毒载重。最重要的是，该疫苗对IHNV 和IPNV 交叉感染具有显著的保护作用，累积死亡率低于6.67%。IHN 多价DNA 疫苗经一次注射免疫后可同时抵抗两种或两种以上病毒的感染，减少了多次注射免疫对鱼体的伤害，并便捷用于生产实践。IHNV、VHSV 和IPNV三种病毒的联合感染使全球鲑鳟养殖业遭受了巨大损失，研发多价DNA 疫苗对鲑鳟养殖业健康可持续发展极为重要。

目前，用于构建IHN DNA 疫苗的启动子有CMV 和IRF1A，表达载体有pcDNA3.1 和pVAX1。其中最常见的是用CMV 和pcDNA3.1 构建IHN DNA 疫苗，但含IRF1A 启动子的疫苗更为安全。对比发现：注射性疫苗的保护效果明显优于口服疫苗，但口服疫苗对虹鳟幼鱼更有实际意义。综上所述，IHN DNA 疫苗具有安全、高效、成本低廉、易于批量生产及免疫剂量少等优点，但DNA 疫苗在生产实践中推广仍存在争议。

3.4 活载体疫苗

IHN 活载体疫苗是将IHNV G 基因重组到无毒力的细菌或病毒基因上，再接种到鱼体表达重组蛋白，诱发机体产生特异性免疫反应。Noonan Brian等[55]将含有VHSV 及IHNV 的抗原表位基因G 穿梭质粒转入杀鲑气单胞菌Aeromonas salraonicida的无毒株A440 中，用活菌苗免疫虹鳟后，可增强其对VHSV 及IHNV 免疫保护作用。李守湖等[56,57]成功构建了含IHNV G 基因的重组腺病毒质粒，与牛奶-海藻糖冻干保护剂1∶1 混合冻干后制成活载体疫苗。研究发现该疫苗安全，浸泡免疫虹鳟后，鱼体内的免疫因子明显上调，保护率可达100%，免疫期可持续6 个月。

综上所述，用杀鲑气单胞菌和腺病毒构建的IHN 活载体疫苗免疫虹鳟后均可同时诱导鱼体产生体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫。未来，针对IHN活载体疫苗，可围绕应用不同的无毒或弱毒载体构建活载体疫苗及其免疫效果和安全性评价进行研究。

4 展望

近年来，IHN 的暴发严重制约了鲑鳟养殖业的发展。为了有效防控IHN 的暴发，进行了大量关于IHN 疫苗的研究。尽管如此，大多数IHN 疫苗研究目前仍停留在实验室水平，并没有商业化投入市场，仅有IHN DNA 疫苗（Apex-IHN）在加拿大被批准上市。徐黎明等[5]构建的IHN DNA 疫苗（pIHNch-G）在黑龙江省已完成中间试验，提交了环境释放申报材料。IHN 核酸疫苗的注射免疫方式的可操作性较低，特别是对小鱼的免疫，费时费力。因此，应加强鱼用口服疫苗的研究，解决鱼用疫苗免疫难的问题。为了保证免疫效果，开发不同疫苗产品，采用两种及两种以上的疫苗来联合应用，如在早期进行口服疫苗，然后再进行注射免疫，实现IHN 的全面防控，为鲑鳟养殖业绿色生态、健康可持续发展提供保障。