鱼类仔稚鱼骨骼及其畸形发生研究进展

韩明洋，周胜杰，马振华

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，热带水产研究开发中心，海南 三亚 572018；3.农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300；4.三亚热带水产研究院，海南 三亚 572018）

随着社会经济的发展，人们对鱼类蛋白质的需求逐渐增加。近海渔业资源的衰退使海水鱼类人工养殖规模逐渐增大，而骨骼发育畸形是人工育苗乃至成鱼养殖过程中的一大难题，在一定程度上影响了海水鱼养殖业的发展[1]。

鱼类骨骼畸形多发生在仔稚鱼期。这个阶段，大多数鱼类要经历一系列的变态发育，受遗传、营养和环境等因素的影响，骨骼畸形是发育过程中的常见现象之一[2]，人工养殖下，仔稚鱼的骨骼畸形现象比野生环境下更加严重[3]。如卵形鲳鲹Trachinotus ovatus 幼鱼的畸形率超过33%[4]，而鞍带石斑鱼Epinephelus lanceolatus 幼鱼的畸形率甚至高达96%[5]。广东等南方地区主要养殖海水鱼类的畸形率在17.5%～25.9%之间[6]。骨骼形态的改变会影响仔稚鱼生理和功能需求等，造成幼鱼进食差，生长缓慢，运动能力弱，具有高应激敏感性，患病机率更高，成活率降低[3,5]，如欧洲畸形鱼苗的成活率低且不受消费者喜欢，多用于制作鱼粉。深入探讨仔稚鱼骨骼发育和骨骼畸形发生规律，可以更好地掌握鱼类在早期发育时的功能发育和趋势以及其对环境和营养等需求，还有助于对鱼苗畸形的认识和鉴定，评估鱼苗质量[7]，利于采取一些可能降低畸形发生率的措施，减少损失，增加收益[1]。研究鱼类骨骼系统发育还有助于丰富人类骨骼发育的研究和人类骨骼疾病药物的研发。

目前，我国广泛研究了各种经济鱼类的骨骼发育和畸形，如半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis[8]、大比目鱼Hippoglossus hippoglossus[9]、卵形鲳鲹[4]、红鳍笛鲷Lutjanus erythropterus[10]等，但多为形态描述，分子水平的深入探索还较少，各因素对鱼类骨骼发育的作用机制以及鱼类骨骼发育的调控通路尚未完全解释清楚。过去缺乏有效的方法来研究早期鱼苗骨骼畸形[3]，而随着科技的进步，软－硬骨双染色技术的改进，X 光投射技术的发展及在鱼类骨骼研究上应用，鱼骨骼的观察变得更加容易；现代细胞和分子生物学、组织学和组织化学等学科和技术不断发展，为骨骼畸形研究提供了很多新的思路和手段，有了深入研究的条件。本文通过综述鱼类仔稚鱼骨骼发育和畸形问题的研究进展，总结近年来分子水平的探索，分析仔稚鱼骨骼早期发育和畸形发生的特点及其主要影响因素，展望鱼类骨骼发育研究方向，以期能更加清晰地认识鱼类骨骼畸形问题，寻找解决和改善方案。

1 海水鱼类仔稚鱼骨骼发育的研究现状

鱼类骨骼发育主要涉及软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞三种骨细胞的综合作用[1]。目前，海水鱼类骨骼研究多集中于经济硬骨鱼类。和其他脊椎动物一样，硬骨鱼类骨形成主要通过两种基本机制，即膜内骨化和软骨内骨化[11]。膜内骨化常见于颅骨的形成，直接通过膜内骨化形成双凹形椎体和小梁的紧密骨；软骨内骨化是由软骨细胞形成的软骨模板，软骨骨化在骨中心进行骨替换，即被含有成骨细胞和破骨细胞的骨替代。

1.1 仔稚鱼骨骼系统及其发育时序

鱼类的骨骼包括中轴骨骼和附肢骨骼。中轴骨骼可分为头骨和脊柱，其中头骨又可分为脑颅和咽颅，包括颌骨、舌弓、鳃弓、悬骨等；脊柱通常分为头区、前血液区、血液区和尾区四大区，包括椎骨、神经弓、神经棘、脉弓和脉棘等。附肢骨骼则分为偶鳍骨骼和奇鳍骨骼，包括胸鳍、背鳍、臀鳍、腹鳍和尾鳍。

卵生初孵仔鱼通常需要经历变态发育各器官才能发育完全，并逐渐成长为成鱼。在此过程中，组织和器官的生长速度不同步，与生存密切相关的组织和器官优先发育，这就是异速生长模式[12]。在骨骼发育中，与摄食、呼吸和运动相关的骨骼优先发育[5]。海水鱼的骨骼发育均存在异速生长模式，但不同种类有所不同，总体上是头部骨骼优先发育，肢体骨骼后发育[13]。鲑科鱼类等的头骨在孵化过程已经开始发育[6]，而大黄鱼Larimichthys crocea[14]等在孵化后头骨才首先发育。海水仔鱼颌骨大多由米克尔氏软骨、下舌软骨、基鳃软骨等构成，其种属之间早期发育时序也不尽相同[6]。如大菱鲆Scophthalmus maximus 仔鱼在2 日龄、全长达到2.7 mm 时即可见软骨结构如米克尔氏软骨等[5]，变态发育起始时颅骨元件基本形成，颌骨等优先骨化Miichthys miiuy 在4 日龄、体长为3.0 mm 时上颌骨以纤维状骨质形式出现，体长为3.7 mm 时出现前颌骨，体长为5.4 mm 时上颌骨和前颌骨完全硬骨化[15]；卵形鲳鲹的颌骨在7 日龄、体长为3.50 mm 时开始骨化，在11 日龄，体长达4.33 mm 时完全骨化[6]。与摄食、呼吸相关的颅骨元件优先发育和骨化[16]。

仔稚鱼脊柱的发育始于背部髓弓、腹部脉棘的形成[17]，不同种属间的发育时序和开始形成的位置不同，骨化方式也存在差异[6]。大菱鲆[5]在12 日龄、全长达到4.1 mm 时，脊柱开始发育；在20 日龄、全长达到10.1 mm 时，脊柱从近头的最前端开始骨化；23 日龄、全长达到13.6 mm 时，脊柱骨化完全。褐菖鲉Sebastiscus marmoratus[18]脊柱发育在13 日龄、全长6.48 mm 时开始，36 日龄、全长为17.8 mm时所有脊柱椎体完成骨化，骨化由头向尾进行。如半滑舌鳎[8]、斑马鱼Danio rerio[13]、大黄鱼[14]等脊柱骨化也是从头向尾部方向进行。美洲鲥Alosa sapidissima[19]在10 日龄、全长达到14.4 mm 时开始脊柱发育，23 日龄、全长达到24.5 mm 时骨化完成，其骨化方向则与大菱鲆等相反，而是从头尾向中间骨化。塞内加尔鳎Solea senegalensis[1]则是神经棘和脉棘最先骨化，再到脊椎骨的骨化。

鳍的发育时序规律同样具有种属间差异，先后顺序多为胸鳍、尾鳍、背鳍、臀鳍、腹鳍[1]，如美洲鲥[19]胸鳍在2 日龄、尾鳍在5 日龄、背鳍在6 日龄、臀鳍和腹鳍分别在10 日龄和16 日龄开始发育；尾鳍在23 日龄时骨化完成，胸鳍、腹鳍和背鳍在24日龄时同时骨化,臀鳍则在30 日龄时完成骨化。仔鱼开口摄食前，胸鳍即出现，如鳜Siniperca chuatsi[20]等的胸鳍在卵黄囊期就已初步形成。胸鳍和尾鳍的较早发育分化有利于仔鱼保持身体平衡和游泳[21]。而菊黄东方鲀Takifugu flavidus[22]等的尾鳍则晚于背鳍等的发育。

仔稚鱼骨骼的数量性状包括椎骨的总数、脊柱的四个部分中包含的椎骨数量，以及尾部尾下骨等数量[1,6]，其在不同种属或者同种的群体之间均可能存在差异，生长不同阶段亦有不同，如大黄鱼[14]在14 日龄时脊椎骨有25 节，16 日龄时则有27 节；大比目鱼[9]头区的脊椎数量随生长逐渐减少，前血液区则逐渐增加。

1.2 鱼类骨骼发育调控基因

研究鱼类骨骼发育内的分子调控机制有助于明确骨骼畸形发生的原因，但目前相关研究多集中在哺乳动物，鱼类的研究相对欠缺。斑马鱼基因与人类有较高的同源性，繁育相对容易，其仔鱼骨骼易于观察，有较高的参考和研究价值，多以其为研究鱼类骨骼发育调控基因的对象[13]。

研究表明，骨骼形成是一个涉及细胞外基质成分、信号分子和转录因子高度调节的分子途径的复杂过程。已在斑马鱼中检验到了Wnt/β-catenin、TGF-β 和Hedgehog 等骨骼发育相关信号通路[13]。Wnt/β-catenin 信号通路对成骨细胞分化作用重大，涉及Gpc4、ptk7 等基因[23,24]，其中Gpc4 参与调控斑马鱼软骨和骨的发生，ptk7 则在调控Wnt 信号转导的多个分支中发挥了重要作用。TGF-β 信号通路与调节细胞增殖、分化，刺激细胞外基质形成有关，涉及骨形态发生蛋白（BMPs）家族、抑制素/活化素家族、生长分化因子等[25]。BMPs 是骨组织形成过程中最关键的调节因子，调节成骨细胞和软骨细胞的生长和分化[26]，其中BMP4 活性较强，在鱼体内广泛表达，在不同时期的仔稚鱼中表达差异显著[27]。Smad 蛋白是TGF-β 信号通路的关键介质，是TGF-β 受体的胞内激酶的底物[28]。Hox 和Shh家族基因同样影响骨骼形成，其表达受到抑制时，会发生畸形[29]。Sox 基因家族与性别决定、性腺和骨骼发育有关，早期软骨细胞分化由sox9 控制，其调节col2a（软骨的主要细胞外基质组分）的转录[30]。在软骨内骨化可能发生之前，mef2c 使软骨细胞转为肥大细胞[31]。矿化的骨和软骨通过破骨细胞的作用进行活性重塑[32]。

随着研究手段的进步，哺乳动物的骨骼代谢途径正在硬骨鱼中被逐渐了解与掌握。然而，软骨形成过程中软骨细胞和成骨细胞的交互作用，骨和软骨发育中遗传相互作用的研究变得复杂化。虽然前期研究描述了这一过程从正常成熟、分化可塑性和软骨形成骨化三个方面的变化[34]，但涉及骨形成分子代谢途径内容仍然远未理解与掌握。

2 仔稚鱼骨骼畸形类型

仔稚鱼骨骼畸形的类型较多，大致可分为头骨畸形、脊柱畸形和鳍畸形三大类。头骨畸形主要有颌骨畸形和鳃盖畸形，前者有米克尔氏软骨弯曲，上下颌短缩或缺失，下颌扭曲，舌弓下沉等[34]，在海水鱼苗种繁育中较为常见。鳃盖畸形主要为鳃盖缺失、鳃盖内折或卷曲等[35]。在所有畸形类型中，脊柱畸形的出现频率最高[36]，在大多数鱼类中均存在。

脊柱畸形可分为脊索畸形、脊柱前凸、后凸或侧凸、椎骨异位、融合或萎缩和神经棘及脉棘畸形等[6,10]，其中脊柱前凸、后凸或侧凸和椎骨融合更为常见。鳍的畸形包括鳍的分叉、融合和增生等[1]，又可分为尾鳍、胸鳍、背鳍和臀鳍的畸形。其中，尾鳍发育对外界刺激更敏感，畸形率更高，主要包括尾下骨融合、鳍条融合和尾杆骨弯曲。背鳍和臀鳍畸形多为鳍条和支鳍骨的融合或分叉等[2]。不同种属间骨骼发育时序不同，骨骼畸形出现的时间顺序也有所不同[35]。个体中可能存在一种甚至多种类型的骨骼畸形。

3 骨骼畸形的影响因素

3.1 遗传因素

遗传因素是鱼类仔稚鱼骨骼畸形的内在因素，但关于遗传因素影响鱼类骨骼发育的机制研究较少。目前的研究表明，鱼类畸形的发生，与亲鱼的基因突变、染色体倍数、杂交育种、近亲繁殖等有关。影响骨骼形成和发育的相关基因发生突变，仔稚鱼骨骼就会畸形，LeClair 等[23]研究发现，硫酸肝素蛋白聚糖（Gpc4）相关基因突变会影响斑马鱼的Wnt/β-catenin 信号通路，造成仔鱼骨骼畸形；Ptk7基因突变可造成斑马鱼脊柱侧凸[24]。而经杂交育种培育的三倍体大西洋鲑Salmo salar 比二倍体个体的畸形率更高；三倍体可能是造成虹鳟Oncorhynchus mykiss 畸形的原因。尽管人工繁育的鱼苗孵化率和成活率比自然条件下高，但较差的基因型个体也得以存活，更易出现骨骼畸形，近亲繁殖也可加剧这一现象。

3.2 环境因素

由内源性营养转变为外源性营养时，仔鱼对环境变化更为敏感。环境因子如温度、盐度、溶解氧、pH、重金属和水体流速等影响神经、肌肉、骨骼或发育过程[6]，造成鱼骨骼畸形。

温度可调节仔稚鱼新陈代谢和摄食行为，是影响鱼类苗种培育的重要环境因素之一。水温过高或过低都可增加仔、稚鱼骨骼畸形率和死亡率。Ma 等[37]研究发现，水温的变化会造成卵形鲳鲹仔鱼骨形态发生蛋白（BMPs）基因表达的差异，在耐受水温范围内，bmp4 的表达均随着水温的升高而升高，颌畸形发生率也随之增加。盐度过高或过低时半滑舌鳎仔鱼畸形率都会增加[38]；在不同盐度胁迫下日本鳗鲡Anguilla japonica 也有相似的结果。溶氧量低可导致大西洋鲑仔鱼的脊柱畸形。铜、锌等金属离子缺乏或浓度过高也会导致鱼类畸形。如高浓度铜离子可导致半滑舌鳎的脊柱和尾部畸形增加[39]。水流速度会导致海鲈Lateolabrax japonicus 脊椎骨畸形[40]。

随着水产养殖业的发展，许多药物也广泛应用在养殖过程中，药物对仔稚鱼的致畸作用也引起了人们的关注。何加发等[41]研究表明，诺氟沙星处理后，鲫obiocypris rarus 亲鱼产卵数减少，仔鱼颌骨畸形率和死亡率增加，调控软骨细胞增殖和膨大的相关基因，如bmp2、bmp4、bmp6、sox9a、lox1、runx2和col2α1 基因表达量显著下降，整体钙含量水平显著下降。用药不当会抑制软骨形成和骨化。

3.3 营养因素

3.3.1 蛋白质

蛋白质在仔稚鱼骨骼发育过程中起重要作用。Akiyama 等[42]发现：缺乏色氨酸可能是大马哈鱼Oncorhynchus keta 和虹鳟脊柱侧凸的原因，投喂含色氨酸饲料时仔鱼畸形率大大降低；用二肽和三肽部分替代海鲈饲料中的蛋白质，可以减少畸形率。其他如亮氨酸、蛋氨酸等能影响仔稚鱼的发育[43]，但其对仔稚鱼骨骼发育的影响尚未有足够的研究。

3.3.2 脂类

鱼类骨骼组织中含有大量的脂质和微量营养素，包括胶原蛋白等[44]；快速生长的仔稚鱼对不饱和脂肪酸等需求更高[1]。而海水鱼类没有合成二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和花生四稀酸（ARA）等长链脂肪酸的能力。这些脂肪酸的摄入量过多或不足时，会抑制仔稚鱼的骨骼发育，造成骨骼畸形[8]。Villeneuve 等[45]发现：日粮中不饱和脂肪酸，尤其是EPA 和DHA 的摄入含量偏低时，海鲈头部畸形和脊柱畸形率上升。目前认为，缺乏这些不饱和脂肪酸可能会影响前列腺素（PGs）、类胰岛素生长因子（IGFs）以及骨形态发生蛋白等骨骼发育相关的基因表达，导致高骨骼畸形发生率，但具体作用机制和通路还有待进一步研究[44]。

3.3.3 维生素

维生素在仔稚鱼骨骼发育中起重要作用，但鱼类本身不能合成或合成很少，主要依赖从食物中获取。视黄酸等物质由维生素A 氧化生成，视黄酸与细胞核内受体RAR 和RXR 结合后可调控BMPs、Shh、Hox 等骨骼发育相关基因的表达[45]，影响软骨细胞成熟和增殖来调节骨形成。日粮中添加适量维生素A 可以促进骨骼发育，但过量时反而加剧了骨骼畸形的发生。高水平维生素A 会导致软骨细胞过快生长和矿化，骨的正常发育时序改变，造成骨骼畸形[44]。Suzuki 等[29]发现，过高视黄酸处理时，牙鲆Paralichthys olivaceus 仔鱼生长受到抑制，畸形率明显上升。

维生素D 影响哺乳动物肠道钙和磷酸盐吸收，促进软骨细胞的形成、矿化以及钙在骨质中的沉积。维生素D 最具生物活性的代谢产物1,25-（OH）-2D3 可通过与维生素D 受体（VDR）结合并调控骨骼发育相关基因的转录，既能促进破骨细胞活性和生成，促进溶骨作用，也可刺激成骨细胞分泌骨钙素和骨胶原等[44]，促进骨的生成。尽管有证据表明鱼类对维生素D 的需要量远高于陆生动物，但目前有关维生素D 对鱼类发育影响及其机制的研究还较少。Sundell 等[46]在大西洋鳕Gadus morhua 的鳃和肠道等组织中发现了1,25-（OH）2D3 受体，证明了该受体对促进鱼体吸收钙的作用。而Darias 等[47]对欧洲鲈Dicentrarchus labrax 仔鱼的研究表明，日粮中维生素D 含量过高或过低均会导致钙离子吸收减少，骨钙素表达水平低，骨骼矿化异常，畸形率上升。

维生素C 是六碳的多羟基内酯，分为可相互转换的还原型和氧化型两种形式，对包括骨骼发育在内的鱼体生物功能起重要作用。脯氨酸和赖氨酸的羟基化是胶原蛋白等形成的必要条件，维生素C 则是脯氨酸和赖氨酸羟基化的必须辅助因子之一。当维生素C 缺乏时，抑制骨胶原生成，影响骨骼发育，可造成骨骼畸形[44]。Muzitano 等[48]研究表明，在适当范围内，摄入维生素C 越多，越有利于虹鳟结缔组织的生成。Ebi 等[49]发现，日粮中维生素C 含量不足时，仔鱼脊柱融合、后凸、前凸和侧弯现象明显增多。

维生素E 是一种优良的抗氧化剂，可保护维生素A 和不饱和脂肪酸免于氧化，清除内外源的自由基对成骨细胞和破骨细胞的影响，促进骨的形成[44]，降低鱼类骨骼畸形的发生，这在对大比目鱼的研究中得到了证明。添加一定量维生素E 的饲料有效降低了仔鱼畸形率。维生素C 作为一种抗氧化剂，能对维生素E 起到一定替代作用[40]。而最近的研究表明，过量的维生素C 和维生素E 的摄入，会导致金头鲷Sparus aurata 体内抗氧化酶基因表达上调，骨骼畸形率显著升高，仔鱼存活率大大降低[50]。

3.3.4 矿物元素

海水鱼类可通过肠道和体表吸收获得矿物质营养，满足生长发育的需要。而众多矿物元素中，钙和磷在鱼体内含量最多，且多在骨骼中，缺乏钙、磷时会影响鱼类骨骼生长。斑马鱼受多氯联苯影响，体内钙磷代谢过程异常，钙含量明显下降时，骨骼无法正常钙化，VDR、PTH 和TRPV6 基因表达上调，BMP2 和BMP4 基因表达显著下调[51]，畸形率增加。水中的钙离子通常能满足鱼的需要，而水中的磷元素含量低且不易被鱼类吸收。食物中磷的摄取量不足时，黑线鳕Melanogrammus aeglefinus 仔鱼骨化程度降低，促进破骨细胞的生成以及骨骼的重吸收，引发脊椎骨骼畸形。

4 展望

骨骼畸形问题制约着海水鱼类养殖业的发展。遗传、环境、营养、疾病和用药等都能影响大多数经济鱼类骨骼的发育和畸形的发生，但多是描述性的研究，各因素产生影响的内在相关机理还不够明确，分子的深入研究较少，在鱼类中的研究进程与哺乳类差距较大。各影响因素间的相互作用，在环境条件难以控制时是否可以通过其他因素进行调节而降低鱼类仔稚鱼的畸形率，提高其存活率尚有待进一步研究。未来鱼类骨骼发育和畸形发生的研究热点，一是更多地引进现代图像技术观察研究骨骼发育，如活体检测的X 射线显微CT 技术，不破坏鱼类样品即可连续追踪鱼类的骨骼发育，得到更加详细和精准的骨骼参数；二是应用现代分子生物与信息技术，综合探究鱼类骨骼发育的内在分子调控机制，如基于高通量测序的转录组技术，预测和筛选各种鱼类骨骼发育相关的基因，探讨不同致畸条件下鱼类全面的分子应答和涉及的相关通路，应用基因敲除技术等进一步确认筛选的基因在骨骼发育过程中的作用，特别是对非模式生物的鱼类，可更好地开展遗传育种工作。