基于铱配合物的组氨酸荧光探针的设计合成

许丙嵩，陈 浩，胡 磊，王 慧

(皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002)

氨基酸是人体内一种非常重要的生物分子，其不仅作为蛋白质的基本组成单元，在生物体其他诸多生理过程中也扮演着不可或缺的作用，如摄入色氨酸可以刺激神经递质血清素的合成和释放，从而改善情绪和睡眠；体内半胱氨酸水平异常会导致皮肤病、肝病的发生；即使是最小的非必须氨基酸，如甘氨酸也具有广谱的抗炎、细胞保护和免疫调节特性[1-4]。因此在生命科学领域对氨基酸的检测十分重要。组氨酸是一种用于蛋白质合成的α-氨基酸，通常被认为是婴儿和儿童的半必需氨基酸，其对成人的重要性也在不断被研究证实。在人体的正常生理活动中，组氨酸的作用是至关重要的，其支链上的咪唑环具有较高的反应活性，是许多金属蛋白和一些特定酶的反应位点，所以组氨酸在生物体系中金属离子的传输和神经递质的传送等方面起着重要作用。但是组氨酸在人体内的含量必须保持在一定的范围内，组氨酸含量的异常往往与许多疾病息息相关，比如类风湿性关节炎、肺疾病、血栓障碍、急性肝衰竭、慢性肾疾病甚至认知障碍等[5-7]。因此，探索一种简洁高效的方法用于检测体内的组氨酸具有重要的科学意义。

目前用于检测组氨酸的方法有库仑滴定法、高效液相色谱法、循环伏安法等[8-10]。但这些方法存在着稳定性差、分析设备昂贵、操作复杂耗时等劣势，而且还不能满足在细胞内进行组氨酸含量的实时监测。近几十年来，随着荧光显微技术的快速发展，荧光探针技术在化学、生命科学及基础医学等领域逐渐发展成为重要的研究工具。与传统的检测手段相比，荧光探针具有分析灵敏度好、选择性好、操作简便、发光可调节性、对生物样品损伤小、可视化观测等优势[11-16]，已经受到越来越多的研究者关注。目前，只有少许识别组氨酸和含组氨酸的蛋白质的荧光探针被报道，这些探针大部分是以有机小分子或铜离子络合物为受体[17-18]，通常它们有荧光寿命短，光稳定性差，对细胞有损伤等缺点，不利于长时间追踪和检测体内的组氨酸。近年来，铱（III）配合物具有较大的Stokes 位移、较长的荧光寿命、发射波长易受配体结构影响等特点，已经被广泛应用于生物显影、化学传感等方面[19-24]。例如，2008 年，Kwok-Yin Wong[25]课题组开发了一种“switch-on”型的铱配合物探针1-CF3SO3。在分子中引入了溶剂分子乙腈和水以作为组氨酸的识别位点。2011 年，李富友[26]科研小组基于上述思想，报道了一种非发射的环金属铱配合物荧光探针LIr1，在分子设计中，引入了溶剂分子二甲基亚砜，该探针具有高的信噪比和良好的生物相容性。基于前期工作，2013年，李富友课题组[27]又设计合成了一系列非发射型的环金属铱配合物（LIr1-LIr8），并在分子中引入了不同的末端基团、溶剂配体以及抗衡离子。

基于上述思想，本文以4-(2-吡啶基)苯甲醛和IrCl3·3H2O 为原料，设计合成了一种新型的铱配合物荧光探针(IrL)(图1)，在分子末端引入醚氧链基团，以提高分子的生物相容性，系统研究了探针IrL 对组氨酸的响应机制，初步探索了探针在细胞成像方面的应用。

图1 探针IrL 的合成路线图

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：IrCl3·3H2O (99.9%)，4-(2-吡啶基)苯甲醛(95%)，牛血清白蛋白BSA(96%)，均购自阿拉丁试剂有限公司，其它药品和试剂为分析纯，实验用水为去离子水。小牛胸腺DNA，RNA 来源于面包酵母，购自Thermo Fisher 公司。人肝癌细胞株(HepG2)来源于皖南医学院药学院中心实验室。

仪器：NicoLet FT-IR-is5 型傅里叶变换红外光谱仪(KBr 压片，日本岛津有限公司)；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF (德国布鲁克公司)；Bruker Avance 400 核磁共振仪(TMS为内标，瑞士布鲁克公司)；UV-5900 PC 紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；HITACHI F-4600 荧光分光度计(日本日立公司)。

1.2 探针IrL 的合成

N2氛围，避光，在100mL三颈烧瓶中依次加入M1(1.34g,4mmol)，IrCl3·3H2O(0.70g,2mmol)，乙二醇单乙醚(15mL)和水(5mL)，在110oC 下反应24 h，反应结束后，冷却至室温，有橘色固体析出，减压抽滤，用乙醇洗涤，得橘色固体M2。称取M2(0.28 g，0.16 mmol)，硝酸银(0.07 g，0.326 mmol)和乙腈(30 mL)依次放入100 mL 三颈烧瓶中，N2保护下回流反应24 h，反应结束后，冷却至室温，减压抽滤，浓缩滤液，加入少量二氯甲烷，再次减压抽滤，除去过量的硝酸银，浓缩滤液，得紫黑色固体IrL 0.38 g。IR (selected bands,cm-1):3442,2923,2867,2426,1636,1607,1562,1478,1431,1384,1272,1196,1097,779,755,570.1H NMR(d6-DMSO,400 MHz)δ:1.08-1.10(t,3 H),2.07 (s,3H),3.23-3.24 (d,2H),3.30-3.53 (m,24 H),3.59(s,2H),4.18-4.21(m,3H),4.56(s,1H),5.74-5.92(m,2H),6.84-6.98(m,2H),7.40-7.46(m,1 H),7.59-7.93 (m,4 H),8.06-8.07 (d,1H),8.26-8.37 (m,3 H),8.68-8.83 (m,1H),9.48-9.64 (m,2H).13C NMR (d6-DMSO,151 MHz) δ:166.7,152.4,128.2,126.9,125.6,125.4,123.9,122.1,120.9,118.5,72.7,72.1,71.9,71.7,70.3,70.2,70.0,69.68,69.4,66.0,60.6,58.4,57.7,15.6,1.6.MALDI-TOF:calculated 997.345,found 935.153 [MNO3-]+.

1.3 光谱性能测试

用二甲基亚砜溶剂配制探针IrL 的母液浓度为10-3moL/L。选择L-苯丙氨酸(Phe)、L-丙氨酸(Ala)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-精氨酸(Arg)、L-赖氨酸(Lys)、L-亮氨酸(Leu)、L-酪氨酸(Tyr)、L-脯氨酸(Pro)、L-色氨酸(Try)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-天冬氨酸(Asp)、L-缬氨酸(Val)、L-异亮氨酸(Iso)、L-组氨酸(His)、L-半胱氨酸(Cys)、牛血清白蛋白(BSA)、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、谷胱甘肽(GSH)、焦磷酸钠(ppi)作为生物分子来源。在测试过程中，移取50 μL 的探针溶液，置于5 mL 的容量瓶中，用磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH=7.4)定容，在所有的紫外可见吸收和荧光光谱测试中，探针IrL 的浓度为10 μmol/L。荧光光谱的测试条件：激发波长为405nm，狭缝宽度均为10.0 nm，电压为500 V。

1.4 细胞毒性与成像

使用人肝癌细胞株(HepG2)细胞作为研究对象，将可传代的HepG2 细胞接种于96 孔细胞培养板中，在37oC，5%CO2条件下培养，当细胞密度长至70-80%左右时，在培养基中分别加入不同浓度的探针IrL(5-30 μmol/L)，同时设置对照组和调零组，每组设三组平行实验。孵育24 h 后，每孔加入10 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二苯基四氮唑溴盐)(MTT)溶液(10 mg/mL)，继续培养4 h。移除培养基，每孔加入100 μL 二甲基亚砜，恒温低速震荡15 min，用酶标仪测定490 nm 处每个孔的吸光值。

将可传代的HepG2 细胞接种于共聚焦小皿中，细胞密度长至60%左右时，分别进行以下两个实验：(1)探针IrL(10 μmol/L)加到共聚焦小皿培养30min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两遍，可直接用于显影。(2) 用4%的多聚甲醛常温固定细胞15 min 后，用PBS 冲洗三遍，然后加入含有探针IrL(10 μmol/L)的新鲜培养基，在37oC 条件下培养20 min，PBS 洗三遍，随后进行显影。

2 结果与讨论

2.1 选择性实验

选择性是评价探针性能的重要指标。人体内环境复杂，探针在细胞内可能会受到生物大分子如DNA，RNA，BSA 以及其他各种氨基酸的影响。为了确定探针对组氨酸的选择性，利用荧光光谱对探针进行选择性测试。向探针中分别加入DNA，RNA，BSA 以及其他氨基酸，并观察探针对它们的荧光响应。如图2(a)所示，探针IrL 本身荧光很弱，当向探针IrL 中加入20 倍当量的组氨酸和BSA(一种含组氨酸的蛋白质)时，探针IrL 显示出明显的荧光增强现象，并伴随着明亮的绿色荧光(图2(b))，而加入其他的生物分子，如DNA、RNA 和其他氨基酸后，探针IrL 的荧光强度没有发生显著的变化。说明探针IrL 可专一响应组氨酸，是一种识别组氨酸和含组氨酸的蛋白质的光开关型荧光探针。

图2 (a)探针IrL 与各种生物分子作用后的荧光发射光谱；(b)在紫外灯(365 nm)照射下，探针IrL 加入组氨酸前后的荧光照片。

为了进一步证明探针IrL 在与其他生物大分子存在时仍对组氨酸具有较高的选择性，进行了与其他生物分子共存的竞争实验。在相同情况下，分别在探针IrL 的PBS 缓冲液中加入20 倍当量的其他生物分子和等量的组氨酸，测试加入组氨酸前后，探针与其他生物分子作用后荧光强度比值(I/I0)的变化。结果如图3 可知，在加入组氨酸前，探针IrL 与其他生物分子作用后的荧光强度比值较低(I/I0<10)，而当组氨酸与其他生物分子共存时，探针IrL 的荧光强度比值明显增强(I/I0>60)，这表明在其他生物分子的存在下，探针IrL 对组氨酸依旧有很高的选择性，而且不受其他生物分子的干扰。

图3 其他生物分子对探针IrL 识别组氨酸的影响。1,Cys;2,DNA;3,GSH;4,ppi;5,RNA;6,Phe;7,Ala;8,Glu;9,Gln;10,Arg;11,Lys;12,Leu;13,Tyr;14,Val;15,Pro;16,Trp;17,Ser;18,Thr;19,Asp;20,IIe;21,BSA;22,His.

2.2 荧光滴定实验

为了进一步探究探针IrL 和组氨酸的作用过程，测得了组氨酸滴加至探针IrL 的PBS 溶液过程中荧光发射光谱的变化。如图4(a)所示，随着组氨酸的加入，探针IrL 的发射峰强度明显增强。以探针IrL 在500 nm 处加入组氨酸后的荧光强度为纵坐标，组氨酸的浓度为横坐标作图，实验结果如图4(b)所示，探针IrL 的荧光强度与组氨酸的浓度在0-1.8×10-4mol/L 范围内具有较好的线性关系，其线性回归方程为y=4.92x-19.13 (R2=0.97)，利用公式3σ/slope[28](slope 为方程中的斜率)可计算出检测限为0.132 μmol/L。

图4 (a)探针IrL 与不同浓度组氨酸反应的荧光发射光谱图;(b)探针IrL 的荧光强度值与组氨酸浓度之间的关系。

2.3 识别机理研究

根据上述实验结果并结合有关文献[25-27,29]，本文初步推测了探针IrL 与组氨酸可能的反应机理，如图5 所示。为了进一步验证此推测，借助MALDI-TOF 质谱图研究探针和组氨酸结合后的产物，从图6 中可以看出，探针IrL 与组氨酸结合后，在质谱图中找到一个与产物IrL-Histidine 相对应的峰，出峰位置在1008.180，这表明探针中的乙腈分子被组氨酸所取代并形成相应的产物。为进一步理解探针IrL 对组氨酸的光学响应，通过激发态的密度泛函理论来研究探针IrL 与组氨酸反应前后的电荷变化，计算采用G09 程序和6-31G*基组(对于C、H、N、O 原子)及LanL2dz 基组(对于Ir 原子)，实验结果如图7 和表1 所示。理论计算结果表明探针IrL 在500 nm 处的发射峰是HOMO 到LUMO 的跃迁，HOMO 和LUMO 轨道的电子云主要集中在配体L 上，是LLCT 跃迁；与组氨酸反应后，产物IrL-Histidine 最大发射峰理论值在504 nm 处，HOMO 轨道上的电子云主要集中在组氨酸配体上，LUMO 轨道上的电子云主要集中在配体L 和金属铱上，是L1L2CT 和L1MCT 的跃迁，反应前后电子云转移的不同，有可能会提高探针的荧光强度。理论计算结果与荧光发射光谱的实验值基本一致，也再次证明了识别机理的合理性。

表1 探针IrL 与组氨酸作用前后的理论计算结果

图5 探针IrL 与组氨酸的可能反应机理图

图6 探针IrL 与组氨酸作用后的MALDI-TOF 谱图

图7 探针IrL 和IrL-Histidine 的分子轨道能级图

2.4 细胞毒性和细胞成像实验

高的细胞存活率是探针在生物学应用的重要条件。在进行生物细胞显影之前采用标准的MTT 法评估了探针IrL 的细胞毒性。图8 显示了探针IrL 作用细胞24h 后的细胞存活率。从图中可以看出，细胞存活率随着探针浓度的增加而下降，但是当探针浓度为25 μmol/L，细胞存活率也保持在80%。综上所述，探针具有较低的生物毒性，可以良好的适用于生物学研究。

图8 不同浓度的探针IrL 对HepG2 细胞的毒性测试。

利用激光共聚焦显微镜对探针IrL 进行细胞成像研究，由图9 可知，探针IrL 与HepG2 细胞共孵育30 min 后，在细胞内的荧光较弱，可能是由于探针分子较大，不利于其进入活体细胞；但当HepG2 细胞用4%多聚甲醛固定后，发现在细胞的细胞核区域展现出较强的荧光信号，说明探针是与细胞内的组氨酸结合从而发出明亮的荧光。此结果表明探针IrL 可着色固定细胞的细胞核区域。

图9 探针IrL 在活的HepG2 细胞和固定后的HepG2 细胞中的共聚焦成像图。标尺为20 μm。

3 结论

本文设计合成了一种用于检测组氨酸和含组氨酸的蛋白质的环金属铱配合物探针IrL。结果表明，探针IrL 可专一性识别组氨酸和含组氨酸的蛋白质伴随着荧光增强现象，且不受其他生物分子的影响。利用质谱和理论计算研究了探针识别组氨酸的机理，结果表明探针中的乙腈分子被组氨酸取代并形成相应的产物。细胞成像结果表明探针IrL 主要聚集在固定细胞的细胞核区域。此实验结果为后期设计铱配合物荧光探针识别生物体内的组氨酸奠定了实验基础。