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衍生化技术在MALDI质谱成像中的应用进展

2021-12-06王珊珊郭寅龙

质谱学报 2021年6期
关键词:化后离子化涂覆

王珊珊,张 强,郭寅龙

(1.长安大学理学院,陕西 西安 710064;2.河南警察学院刑事科学技术系,河南 郑州 450046;3.中国科学院上海有机化学研究所,金属有机化学国家重点实验室,上海有机质谱中心,上海 200032)

质谱成像技术可以原位测定样本切片表面分子相对含量分布,与其他生物成像技术相比,该技术可以在单次质谱成像实验中获得多个目标化合物相对含量分布的可视化图像,具有灵敏度高、无需标记等优点。质谱成像技术有不同的离子化方式,目前最常见的有次级离子质谱(secondary ion mass spectroscopy, SIMS)成像[1-5]、解吸电喷雾离子化(desorption electrospray ionization, DESI)质谱成像[6-8]以及基质辅助激光解吸离子化质谱成像(MALDI MSI)[9]。其中,MALDI MSI由范德堡大学的Richard Caprioli教授等[10]于1997年提出后,现已成为应用广泛且较为成熟的质谱成像技术。MALDI MSI具有较高的灵敏度及空间分辨率,相比于DESI和SIMS质谱成像,其可以耐受一定浓度的盐和缓冲溶液,实现较宽质量区间的化合物成像分析。另外,MALDI MSI的成像空间分辨率可以低至10 μm,对于不同类型的样本,例如植物组织[11-12]、动物组织[13-14]、毛发样本[15-17]、指纹样本[18-19]等均能实现目标分析物的成像分析。

虽然MALDI MSI的优势突出,但是仍有自身的局限性。首先,MALDI MSI检测灵敏度有限,只能应用于组织中相对高丰度、高离子化效率的化合物的成像,例如脂质[20-22]和蛋白[23-25]等;对于脂肪酸、氨基酸及一些小分子药物等丰度低、离子化效率低的化合物的成像分析仍然极具挑战。另外,MALDI MSI中应用的基质所产生的信号峰还会对小分子化合物的成像分析产生极大的干扰,因此通过在样本上预先对待分析物进行原位衍生化后再成像分析是非常必要的。

衍生化方法是一种通过将目标化合物与衍生化试剂发生化学反应,从而为响应较差的目标化合物带上性质修饰基团,进而改变化学性质,并将其定量转化为信号响应较强的化合物。化学衍生化方法可以追溯到20世纪60年代,对于氨基酸的快速乙酰化及酯化反应的应用,该衍生化反应的目的是为了改善气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析中蛋白、多肽中氨基酸的定性问题,其中三氟乙酸酐和甲醇作为衍生化试剂用于氨基酸的快速乙酰化和酯化反应[26]。经过多年的发展,衍生化方法已在GC-MS[27-28]、液相色谱-质谱(liquid chromatograph-mass spectrometer, LC-MS)[29-31]和基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI MS)[32-34]中得到了广泛应用,尤其是对于离子化效率低、丰度低的目标化合物的定性定量分析展示了其独特的优势。将衍生化方法应用于MALDI MSI中,用于改善目标化合物的质谱响应,对于克服MALDI MSI应用中的局限性,拓展其应用范围具有重要意义。

本文将综述MALDI质谱成像的原理、前处理方法及近年来开发的针对不同活性基团的衍生化方法,并总结该研究方向面临的挑战以及未来的发展趋势。

1 MALDI MSI的基本原理

MALDI的解吸离子化机理示于图1。激光照射到样品表面,样品吸收激光发生能量传递,并将分析物溅射到气相中实现离子化。由于很多样品分子不吸收激光,所以在样品前处理时会预先将目标分析物与具有紫外吸收的化合物(基质)混合,共结晶后进行目标分析物的解吸离子化,在此过程中,基质起到了吸收激光、传递能量和辅助离子化的作用。

图1 MALDI原理示意图Fig.1 Schematic diagram of MALDI

MALDI MSI是在MALDI MS基础上进一步发展的技术,其基本原理是通过在切片样本的每个像素点进行MALDI MS分析,得到一张平均质谱图,然后通过质谱图数据的整合和处理,获得数据的可视化图像。

MALDI MSI在数据采集过程中,首先将涂覆好基质的切片样本网格化为微米级的像素点,然后在每个像素点中获得一张平均质谱图,图中目标分析物的峰强度在经过提取后可以与色彩强度一一对应,对应后的目标分析物峰强度分布以图像的形式呈现出来,从而得到目标分析物在样本表面相对含量分布的可视化图像。由于一张质谱图中包含不止一种化合物的信号峰,所以单次质谱成像实验便可同时获得多个目标化合物在样本表面相对含量分布的可视化图像。这是质谱成像技术相比于其他生物成像技术的独特优势。

2 衍生化技术在MALDI MSI中的应用流程

传统的MALDI MSI实验通常包括样本冷冻切片、基质沉降共结晶及成像数据采集和数据处理与呈现等过程。衍生化结合的MALDI MSI实验相比于传统的MALDI MSI实验,增加了衍生化试剂的涂覆步骤及一定的衍生化孵育时间(incubate time)。在衍生化试剂涂覆后,有时还需要将样本切片在甲醇蒸汽存在的密闭容器中孵育一定时间,以提高衍生化反应的产率。样本上原位衍生化相结合的MALDI MSI实验流程示于图2,其中对于衍生化试剂与基质的涂覆方式,不同的样本和衍生化反应会有较大区别。后续将对含有氨基、羧基、醛基和碳碳双键等不同活性基团的目标分析物所对应的不同类型的原位衍生化方法进行详细介绍。

MALDI MSI中的衍生化需要直接将衍生化试剂涂覆在组织样本上,并对样本中的分子进行原位快速衍生化,相比于溶液相的衍生化反应,MALDI MSI对于衍生化反应的条件要求更加苛刻,这就需要研究人员精准优化及调控衍生化反应的温度、衍生化时间及衍生化试剂的用量等,尽可能的缩短衍生化时间、降低目标分析物的移位和离子抑制现象。

3 成像基质的选择

成像基质的选择主要由样本类型及目标分析物的分子质量等因素决定。衍生化相结合的质谱成像实验中的基质除了需要具备吸收激光、传递能量、辅助离子化的作用外,还需要满足以下条件:1) 不抑制或参与衍生化反应;2) 基质峰对衍生化产物峰的干扰小;3) 可以在真空中长时间稳定存在。在衍生化结合的质谱成像实验中,大多使用MALDI MS中常用的传统有机基质。例如,2、5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、α-氰基-4羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)、芥子酸(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, SA)等,这些基质所适用的分析物类型也基本与MALDI MS一致。例如,对于脂肪酸及脂质衍生化后的成像分析常选用DHB作为基质,而对于神经递质、多肽、蛋白[35]等常选择CHCA或SA作为基质。其中在MALDI MS中应用较多的无机纳米基质(如氧化石墨烯以及离子液体基质等),而在衍生化结合的MALDI MSI中较少使用。

除了使用这些传统基质外,在衍生化结合的质谱成像研究中还衍生出另一类基质,即反应基质[36-41]。反应基质在成像过程中除了作为衍生化试剂用于衍生化目标分析物,还可以作为成像基质使用。反应基质的优点是减少了基质和过量的衍生化试剂的双重干扰,省去了衍生化试剂或基质的涂覆步骤,使得实验流程更加简便。由于反应基质的优点突出,使其在不同类型的目标分析物中得到应用,例如在儿茶酚胺[41]、脂质双键[40]、神经递质[38]等,对应的反应基质结构列于表1。

4 衍生化试剂和基质的涂覆装置

衍生化试剂和基质的涂覆方式不仅影响组织上原位衍生化反应效率,还会对质谱成像结果产生较大的影响。如果衍生化试剂及基质的沉降不均匀,将难以实现较高空间分辨率的成像,因此采用合适的涂覆装置对于组织上原位衍生化结合的质谱成像实验至关重要。一般来说,基质的涂覆装置同样适用于衍生化试剂的涂覆。用于质谱成像的试剂涂覆装置示于图3。该装置可分为两大类:一类是有溶剂参与的,例如电喷雾类型的装置;一种是无溶剂参与的升华装置(图3c)。由于衍生化反应通常在有溶剂参与时的效率更高,所以衍生化试剂在涂覆时通常采用有溶剂参与的微小液滴沉降方式,其中在基质涂覆中应用较多的升华方式在衍生化试剂的涂覆中应用较少。成像中试剂的涂覆最早采用移液枪点涂的方式[42],在用于小分子分析时会造成严重的移位现象。近年来,用于MALDI MS的商品化和非商品化的基质沉降装置层出不穷[43-44]。商品化的装置有气动喷枪,示于图3a,其优点是价格低廉、操作简便,在质谱成像发展初期被广泛使用。但是该装置的缺点也很明显,由于是手动喷涂,所以受环境和人为的影响较大,很难得到重现性较好的实验结果,且结晶的晶体大小难以满足较高空间分辨的成像分析。另外,商品化的基质喷涂装置,如布鲁克公司的自动基质喷雾仪ImagePrep(Bruker Daltonics),示于图3b[45-46]。该装置可以实现基质的自动化喷涂,是目前常用的基质沉降装置。自动化的基质沉降装置除了ImagePrep外,还有喷墨打印基质喷涂装置[47-48]。喷墨打印装置的优点是位置控制精准,但是喷头容易堵塞,不易清洗。非商品化的装置主要是基于电喷雾原理改装的基质喷涂装置,示于图3d[49-50]。电喷雾装置在高电压和辅助气存在下,通过调整喷针尖端与组织表面的距离可以形成较好的喷雾液滴,通过优化参数可以使基质结晶不超过1 μm。目前用于成像中试剂涂覆的装置主要向小型化、价格低廉、操作简便、重现性好的方向发展,如聂宗秀课题组[51]使用价格低廉的雾化器用于基质沉降,并将其成功用于脑组织成像,示于图3f。雾化器的基质喷涂装置与ImagePrep相比,得到的分析物质谱响应更高,质谱的成像空间分辨率更高。另外,Mackay课题组[52]将电喷雾与液相体系相结合,实现了基质喷涂的自动化,且实验装置成本低廉。

注:a.气动喷枪;b.自动基质喷雾仪;c.升华装置;d.电喷雾基质喷涂装置;e.喷墨打印;f.迷你加湿器图3 用于MALDI MSI的基质喷涂装置Fig.3 Instruments for the deposition of matrix in MALDI MSI experiment

5 不同活性基团化合物的衍生化

生物样本中的化合物分子可以按照含有的活性基团进行划分,例如含有氨基、羰基、醛基、羟基等的化合物。对于含有不同活性基团的化合物,衍生化试剂的设计及衍生化条件的选择也有很大的区别。下面将对含有不同活性基团的化合物对应的衍生化结合的MALDI MSI方法进行分类介绍。

5.1 氨基的衍生化

生物体内含氨基的化合物众多,例如神经递质、氨基酸和多肽及一些外源的药物分子等[53]。氨基类化合物在生物体内的变化与很多疾病的发生及发展密切相关。例如,神经递质的变化与偏头痛[54]、中风[55]、抑郁症[56]及阿尔兹海默症[57]等疾病密切相关。因此,对含氨基类化合物进行成像分析,有利于理解这些疾病的病理生理特征。然而,一些含氨基类化合物的离子化效率较低,在成像过程中易受基质峰的干扰,有必要对其衍生化后再进行成像分析。

对于含氨基类化合物的衍生化,最早是Fournier课题组[58]为了改善MALDI MSI对于蛋白“自下而上”的成像分析,首次将衍生化技术引入MALDI MSI,对组织上酶解后的多肽N端进行了化学衍生化。研究人员分别尝试了通过衍生化反应在多肽N端引入负电荷基团及正电荷基团。关于负电荷基团的引入,研究人员比较了异硫氰酸4-磺苯基酯(4-sulphophenyl isothiocyanate, 4-SPITC)及3-磺基苯甲酸(3-sulfobenzoic acid succinimidyl ester, 3-SBASE)两种衍生化试剂,发现3-SBASE具有更高的衍生化效率,可以得到更丰富的碎片信息,而缺点是只有气相碱度更高的N端为精氨酸的多肽在衍生化后能被检测到。研究人员随后又尝试引入正电荷基团,采用(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP)作为衍生化试剂,发现TMPP的优势在于反应在室温下即可发生,且衍生化的发生不依赖多肽N端的碱性氨基酸的存在。通过比较不同的衍生化方法,证实了衍生化具有改善MALDI-MSI蛋白“自下而上”分析的作用。

Caprioli课题组[59]在此基础上提出使用1,1′-硫羰基二咪唑(1,1′-thiocarbonyldiimidazole, TCDI)对小鼠肾组织中的3-甲氧基水杨酰胺(3-methoxysalicylamine, 3-MoSA)进行衍生化后的质谱成像,以克服3-MoSA在MALDI MSI检测时易受基质离子干扰和灵敏度低的问题。通过TCDI的衍生化,组织中3-MoSA的检测限从200 pmol降至fmol级。随后,Caprioli课题组[60]还将组织上原位衍生化方法应用于抗结核药物异烟肼的质谱成像分析。对于异烟肼的衍生化,研究人员采用反式肉桂醛作为衍生化试剂,采用预先涂覆的方式,即先将衍生化试剂涂覆在氧化铟锡导电玻片上,再贴附组织样本,不仅简化了实验步骤,还可以减少组织样本中异烟肼的移位现象。在此基础上,研究人员通过比较10个化合物对于氨基代谢物的衍生化产物数量,选择了一种内源性氨基代谢物的衍生化试剂4-羟基-3-甲氧基肉桂醛(4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde, CA)。利用该衍生化方法结合串联质谱成功地对鼠脑组织中的内源性氨基酸、神经递质进行了衍生化后的质谱成像分析及验证[61]。郭帅等[62]受激光诱导正向传输(laser-induced forward transfer, LIFT)技术的启发,开发了一种激光辅助组织传输(laser-assisted tissue transfer, LATT)技术用于组织上原位衍生化。LATT技术可以缩短衍生化时间,增强衍生化反应效率。研究人员将该技术用于CA原位衍生化方法的质谱成像中,发现相比于之前的CA原位衍生化方法,衍生化时间明显缩短,且衍生化产物的信号强度提高了20~235倍。

为了进一步提高衍生化产物的质谱响应,Toue等[63]采用p-N,N,N-三甲基氨基-N′-羟基丁二酰亚酰甲酸酯碘化物(p-N,N,N-trimethylammonioanilyl-N′-hydroxysuccinimidyl carbamate iodide, TAHS)作为衍生化试剂,对人结肠癌移植瘤小鼠肝组织中的氨基酸进行衍生化,以提高氨基酸的离子化效率和成像灵敏度。TAHS可以与氨基酸发生亲核取代反应形成脲基化合物,由于衍生化产物中含有季铵盐端的阳离子部分,因而衍生化后氨基酸的离子化效率大幅提高。由于氨基酸衍生化产物离子峰与DHB基质峰有重叠,研究人员通过衍生化产物的串联质谱进行了氨基酸的成像分析。结果表明,谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和丙氨酸这8种氨基酸在转移瘤组织中的含量明显高于肝实质区域。说明组织上TAHS衍生化方法结合质谱成像技术有利于理解疾病相关的氨基酸含量的分布变化。

对于含氨基的神经递质的衍生化,Andren课题组[37-38]选择吡喃鎓盐作为反应基质,其可以与一级胺在室温下快速反应形成吡啶盐,衍生化后不需要额外的基质辅助离子化。通过比较,研究人员选择了2,4,6-三苯基吡喃四氟化硼盐(2,4-diphenyl-pyranylium tetrafluoroborate, DPP-TFB)用于神经递质的组织上原位衍生化。DPP-TFB不仅可以作为衍生化试剂,过量的DPP-TFB还可以直接作为基质使用,避免了过量衍生化试剂的干扰。衍生化产物由于具有吡啶正离子基团,因而可以显著提升神经递质的解吸和离子化效率。研究人员将DPP-TFB衍生化方法用于帕金森病模型鼠脑组织中多种神经递质的同时成像分析,成像空间分辨率低至15 μm。在此基础上,还使用氘代神经递质的标准溶液绘制了标准曲线,用于神经递质的MALDI MSI定量分析,结果清楚地显示了疾病相关的神经递质的含量分布差异,体现了质谱成像技术对于多种化合物同时成像分析的独特优势。随后,McDonnell等[64]进一步对CA、TAHS和DPP-TFB这3种衍生化试剂进行了结合与条件优化,得到了鼠脑组织中23种氨基代谢物的含量分布。

5.2 含羰基化合物的衍生化

生物体内含有活性羰基基团的化合物种类繁多,其中研究较多的是类固醇类化合物。类固醇激素具有调节免疫、抗炎及促进发育等功能,它的含量异常变化与很多疾病密切相关,例如乳腺癌、肥胖症和前列腺癌等[65]。因此,生物样本中类固醇激素的定量分析对于相关疾病的诊断治疗具有重要意义。质谱法是血液中类固醇定量的金标准,然而血液中激素含量的变化很难归结是具体某个器官带来的。质谱成像技术的引入则使得对类固醇的研究进入到更直观的特定组织分子层面。类固醇激素是一类四环脂肪烃化合物,在MALDI过程中具有丰度低、离子化效率低的特点,直接进行MALDI MSI分析存在难点。由于类固醇分子结构中一般存在活性羰基及羟基基团,对其衍生化后再进行质谱成像分析可以明显提高检测灵敏度。Andrew课题组[66]采用吉拉德试剂T (Girard’s reagent T, GirT)结合MALDI MSI对糖皮质激素放大酶的底物11-脱氢皮质酮(11-dehydrocorticosterone ,11DHC)及产物皮质酮(corticosterone, CORT),以及7-酮基胆固醇进行了衍生化后的质谱成像分析。中性皮质类固醇中的α-β不饱和酮部分可以与GirT反应生成带正电荷的腙类化合物,从而显著提高成像灵敏度。衍生化后组织上皮质类固醇激素的检测限低至0.1 pg。质谱成像结果显示,皮质类固醇在鼠脑组织中的大脑皮层、海马体以及杏仁核区域的丰度更高。作者还通过对糖皮质激素放大酶11β-HSD1缺陷小鼠中11DHC 和CORT进行成像分析,以揭示11DHC和CORT含量比例变化与11β-HSD1酶活性之间的关系,其中MALDI MSI空间分辨率为150~200 μm。随后,Andrew课题组[67]还将GirT衍生化方法应用于鼠睾丸组织中睾酮与5α-二氢睾酮(5α-dihydrotestosterone, DHT)的成像分析,衍生化后睾酮的检测限低至0.1 pg。通过优化衍生化条件及改变试剂沉降装置,显著提高了实验的重现性及试剂在组织上分布的均匀性,成像分辨率低至50 μm,实现了更高分辨的质谱成像。质谱成像技术在类固醇成像中的成功应用有助于胞内分泌学的发展。

除了内源的类固醇分子,对于外源的类固醇药物分子的衍生化也有相关应用。虽然医学上有很多成熟的疾病影像检查手段,例如超声检查、计算机断层扫描、磁共振成像和正电子发射断层扫描等,且这些检查方法对患者的诊断或随访很有效,但还是不能从生物分子层面提供对疾病病理的理解。MALDI MSI由于具有可同时得到多个分子的高分辨成像信息,近年来已有多篇在药物分子成像分析方面应用的报道[68-70]。Cillero-Pastor等[71]将GirT衍生化方法应用于软骨组织中外源类固醇类药物分子曲安奈德(triamcinolone acetonide, TAA)的成像分析。曲安奈德是一种合成的皮质类固醇药物,可以用于减轻骨关节的炎症和疼痛[72],了解TAA药物的局部分布有助于调整关节内药物治疗的用量和给药方式。然而软骨组织中无血管分布,很难直接测定TAA在软骨组织中的渗透能力和含量分布。MALDI MSI技术对于TAA分子的直接成像分析也极其困难,这是因为TAA分子在MALDI过程中的离子化效率很低。为解决这一难题,Cillero-Pastor课题组[73]通过比较2,4-二硝基苯肼和GirT两种衍生化试剂,选择GirT对软骨组织中的TAA进行衍生化后的质谱成像。使用GirT衍生化方法成功地成像和定量了TAA在软骨组织中的含量分布,相比于未衍生化方法的检测灵敏度显著提升。

对于类固醇药物的衍生化,Flinders等[36]还采用了4-二甲氨基-6-(4-甲氧基-1-萘基)-1,3,5-三嗪-2-肼(4-dimethylamino-6-(4-methoxy-1-naphthyl)-1,3,5-triazine-2-hydrazine, DMNTH)反应基质,对治疗哮喘的药物丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)进行了衍生化后的质谱成像分析。该试剂最早由Karst课题组[74]报道用于含有羰基化合物的板上衍生化的反应基质。Flinders等[70]通过优化原位衍生化条件,将DMNTH衍生化方法成功应用于鼠肺组织中丙酸氟替卡松的质谱成像分析。研究人员发现,为了提高检测灵敏度及降低检测限,衍生化时间需要延长到48 h,且DMNTH作为反应基质时,需要混入少量的CHCA基质。

除了类固醇类分子中羰基的衍生化,Enomoto等[75]还采用GirT衍生化方法对植物种子中的脱落酸与12-氧-植物二烯酸中的酮羰基进行了衍生化后的质谱成像分析。显示了GirT衍生化方法在不同类型样本质谱成像分析中的应用潜力。

5.3 羧基衍生化

含羧基组织上原位衍生化的工作主要包括对聚糖及脂肪酸中的羧基衍生化。N-聚糖参与许多细胞代谢过程,例如细胞间相互作用、免疫应答和细胞分化等,具有作为疾病生物标记物和治疗靶标的巨大潜力[76]。定性定量分析其含量变化可以揭示相关疾病的发病机理。然而,对于N-聚糖直接MALDI-MS和MSI分析仍然具有挑战,这主要是因为N-聚糖中存在的唾液酸结构具有不稳定的特性,易于在源内/源后降解,且唾液酸中的羧基存在不利于正离子检测模式下聚糖的离子化。Wuhrer课题组[77]对组织中的N-聚糖进行了组织上原位二甲基酰胺化后的质谱成像分析,该衍生方法可以对N-聚糖中不同连接方式(α2,3或α2,6构型)的唾液酸实现差异衍生化,得到具有28.031 u质量差异的衍生化产物,从而分别对含有不同构型唾液酸结构的N-聚糖进行成像分析。MALDI MSI结果显示,N-聚糖在结肠癌以及福尔马林固定的平滑肌肉瘤组织中不同区域的差异分布,且相比于未衍生化的N-聚糖的质谱成像分析结果得到了明显改善。

游离脂肪酸作为生物体内重要的合成中间体,参与了很多重要的代谢过程,例如脂质代谢及糖代谢过程,脂肪酸在生物体内含量的变化与很多疾病的发生发展密切相关[78]。利用MALDI MSI对脂肪酸含量分布、变化进行成像分析,可以很好地揭示脂肪酸所参与的疾病相关的代谢过程。然而,脂肪酸这类分子具有丰度低、相对分子质量低(200~400 u)、离子化效率低的特点,直接对其采用MALDI质谱成像分析仍然极具挑战,因此通过在组织上先对脂肪酸原位衍生化后再进行成像是非常必要的。对于脂肪酸的衍生化,Sweedler课题组[79]利用2-氨甲基吡啶作为衍生化试剂对鼠脑组织中的内源脂肪酸进行了组织上原位衍生化,在衍生化后的质谱成像分析中得到了6个脂肪酸的成像信息。该工作创新性地使用电喷雾装置进行衍生化试剂的沉降,不仅改善了目标分析的移位现象,还显著缩短了衍生化时间,成像的空间分辨率低至20 μm。

图4 磷脂与脂肪酸同时质谱成像分析示意图Fig.4 Schematic diagram of simultaneous mass spectrometry imaging analysis of phospholipids and fatty acids

本课题组[80]设计合成了与磷脂具有相似季铵盐端的衍生化试剂N,N-二甲基哌嗪碘盐(N,N-dimethylpiperazine iodide, DMPI),用于脂肪酸与磷脂的同时质谱成像分析,示于图4。相比于2-氨甲基吡啶脂肪酸衍生化方法,DMPI衍生化后脂肪酸的检测灵敏度提高了1~2个数量级。这是因为DMPI中哌嗪基团与羧基的反应活性更高,生成的衍生化产物中季铵盐端的离子化效率更加优异。采用DMPI组织上原位衍生化方法,实验中仅使用一个组织样本切片便可以同时得到脂肪酸和磷脂的质谱成像信息。该原位衍生化策略成功地实现了甲状腺癌组织与癌旁组织中脂肪酸与磷脂的同时质谱成像分析。本课题组在得到两类分子的空间差异分布信息后又进行了不同分子间的相关性分析,结果表明脂肪酸的从头合成在甲状腺癌组织中更加活跃,这也进一步揭示了脂质的差异代谢与肿瘤的发生密切相关。

5.4 脂质异构体中碳碳双键的衍生化

5.5 羟基、巯基衍生化

含有羟基的化合物主要是一些毒品分子及神经递质。毒品分子及蛋白分子衍生化毒品可以通过血液循环进入头发毛囊中,其相比于血液、尿液中的毒品更不易受外部环境影响。一直以来,头发毒品检测技术是药物依赖防治研究领域的热点。近年来,MALDI MSI已应用于头发样本中违禁药物的成像分析,例如甲基苯丙胺[89]、克他命[90]和可卡因[91]等的成像分析。四氢大麻醇(tetrahydrocannabinol, THC)是在世界范围内滥用最广的毒品,其在生物体内和体外的代谢路径和代谢产物不同,为了分辨是否来自外源污染,将这些代谢物分别进行成像分析是非常必要的。Bassindale等[92]采用2-氟-1-甲基吡啶翁对甲苯磺酸盐(2-fluoro-1-methylpyridinium ptolunesolfonate,FMTPS)对头发中的THC及其代谢物进行了衍生化后的质谱成像分析。THC及其代谢物中的酚羟基可以与FMTPS发生快速温和的反应,由于衍生化产物中具有季铵盐结构,使后续成像的灵敏度显著提升。另外,通过FMTPS衍生化方法还实现了THC及生物体内、体外代谢物的分别成像分析。

儿茶酚胺类化合物作为神经递质的一种,参与调节了很多生物学过程和行为。儿茶酚氨结构中含有邻双酚基,去甲肾上腺素、多巴胺和肾上腺素均属于儿茶酚胺类化合物。这类分子在成像过程中易受基质及组织内源物质抑制,离子化效率较低。Fletcher等[41]合成了一种吡啶硼酸盐类化合物4-(N-甲基)吡啶硼酸(4-(N-methyl)pyridinium boronic acid)作为反应基质,用于儿茶酚胺类分子中双酚基的衍生化。4-(N-甲基)吡啶硼酸成功地对猪肾上腺组织中的去甲肾上腺素、多巴胺和肾上腺素进行衍生化,随后的无标记激光解吸电离质谱成像(LDI MSI)分析显示了这3种分子在组织中不同区域的分布强弱。研究人员也认为,4-(N-甲基)吡啶硼酸衍生化方法具有应用于含氨基醇、二醇、糖类化合物衍生化后的成像分析潜力。

对于含巯基化合物的衍生化,Rittne等[93]报道了一种用于组织中含有游离硫醇基团的大分子蛋白和小分子代谢物的原位衍生化成像方法。该方法使用三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)-phosphine,TCEP)对组织中的含硫醇化合物进行还原,然后采用CHC-Mal作为衍生化试剂进行原位衍生化,结构列于表1。研究人员将CHC-Mal衍生化方法应用于猪胰腺组织中还原后的胰岛素质谱成像,成功得到了衍生化后的胰岛素α-链和β-链在组织中的含量差异分布。另外,还将CHC-Mal衍生化方法应用于猪肝组织中谷胱甘肽的MALDI MSI分析,结果表明,衍生化后的谷胱甘肽具有更好的质谱响应。

5.6 铂类药物分子衍生化

抗癌药物中包含很多含铂类药物,例如奥沙利铂、卡铂和顺铂等。铂类药物被广泛应用于临床,给药后在组织中的含量分布研究主要依靠荧光成像法,其缺点是对于不含荧光基团的药物分子需预先连接荧光基团。许多研究表明,加上荧光基团后的药物分子在组织中的分布可能会与药物分子本身的分布存在差异。基于此,开发辅助性的成像方法是很必要的。MALDI MSI虽然能得到部分铂类药物分子的成像信息,但大多数分子的质谱响应都很弱。Liu等[94]将乙基二硫代氨基甲酸酯(diethyldithiocarbamate, DDTC)用于MALDI MSI的原位衍生化中,以提高铂类药物分子成像中的质谱响应。DDTC是一种亲核性的含硫化合物,可以作为螯合剂与多种金属离子形成金属配合物,之前已被用于液相色谱-质谱联用中铂类药物分子的定量分析[95]。作者通过优化衍生化方法将其用于铂类药物奥沙利铂的衍生化试剂,衍生化后奥沙利铂的质谱响应显著提升,成功实现了多细胞肿瘤球体切片中奥沙利铂分子的衍生化及MALDI MSI分析。

6 展望

MALDI MSI分析一些低丰度、离子化效率低的化合物时,通常会因检测灵敏度低、离子化效率差、离子抑制、分析物源碎裂以及MALDI基质和内源性成分的背景峰干扰而受到阻碍。将样本原位衍生化方法应用于MALDI MSI,可以显著改善这些化合物MALDI MSI的成像效果,原位衍生化与MALDI MSI的结合扩大了MALDI MSI的应用范围。由于样本上的原位衍生化方法的衍生化条件较为苛刻,所以需要对衍生化试剂、衍生化反应及成像流程进行合理的设计和优化,以实现衍生化与MALDI MSI的优势互补,否则原位衍生化方法就可能成为一把“双刃剑”,在衍生化过程中会伴随大量分子成像信息的丢失。对于原位衍生化结合的MALDI MSI,如何设计更高效的衍生化试剂、降低离子抑制现象以及对目标分析物的准确定量等均是需要进一步研究的问题。

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