响应面法优化桂花酒酿造工艺

张阳阳，侯贺丽，王荣荣，李建芳，郝晨晖

（信阳农林学院 食品学院，河南 信阳 464000）

桂花是信阳市的市花，含有多种重要的生物活性物质，其中黄酮类、多酚类等活性物质含量很高，且对人体内各种自由基有一定抑制作用[1-4]。桂花酒历史悠久，古人认为桂为百药之长，用桂花来酿酒可以达到“饮之寿千岁”的功效，该酒香甜醇厚，有开胃醒神、健脾补虚的功效[5-7]。桂花酒对女士特别适用，被赞誉为“妇女幸福酒”[8]。目前对于桂花酒的研究主要集中在浸提制取工艺、香气成分分析与抗氧化研究等方面，如黄梦明等[9]对新型桂花酒的浸提工艺进行研究及抗氧化评价，结果表明浸提工艺生产的新型桂花酒，总黄酮提取率可达到91.34%，并具有较强的抗氧化能力；杨淇等[10]研究了桂花酒的制备与其香气成分分析，结果表明以浸泡法制备的桂花酒，香气成分检测出24种可挥发性成分，香气浓郁，但在发酵桂花酒方面研究较少。

因此本试验以信阳本地的大米和桂花为原料，以黄酒发酵工艺为基础制作桂花酒并对其工艺进行优化，拟开发一种新型发酵型桂花酒。首先利用植物乳杆菌（Lactobacil-lus plantarum）对大米进行酸化，其次以安琪酵母和麦曲共同发酵消除生物胺对酒口感和饮后舒适度的不良影响，以期提高酯类物质使酒更加绵柔，提高其营养价值[11-13]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米：信阳香丝苗米；桂花：信阳农林学院校园桂花自采自晒；安琪耐高糖高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌冻干粉（食品级）：郑州百益生物技术有限公司；麦曲：老河口市任家米酒黄酒加工厂；无水乙醇（体积分数98%）：郑州派尼化学试剂厂；冰乙酸（分析纯）：天津市巴斯夫化工有限公司；亚铁氰化钾（分析纯）：郑州派尼化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

LDZM-80L-Ⅲ立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；ZHJH-C1112C超净工作台：上海分析仪器制造有限公司；HH-6电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；SPX-150-BS-Ⅱ生化培养箱：北京中兴伟业世纪仪器有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 桂花酒发酵工艺流程及操作要点

操作要点：

大米预处理：选取优良大米，清洗后置于容器中，加入植物乳杆菌于培养箱中进行生酸，在浆水pH降至4.2左右，即可停止发酵[14-17]。

植物乳杆菌按0.1%（以干米500 g为基准）添加，在18 ℃培养至pH值达4.2左右停止，确定浸米时间，以缩短传统浸泡浸米时间。

蒸饭：处理后的大米淘洗干净放到锅中蒸70～90 min，蒸至无夹心、不沾粘、颗粒（较）松散。

淋饭、冷却：用预先准备好的冷却水少量多次对其进行降温，冷却至30 ℃左右。

糖渍桂花：干桂花放入质量浓度为1 g/100 mL的盐水中浸泡5 min，然后控干水分。再大火蒸10 min。将等质量的冰糖（食品级）加适量的水熬制成糖浆，将桂花倒入进行翻拌。冷却后装罐并用蜂蜜封顶，放入冰箱冷藏7 d后使用。

接种：麦曲粉碎，将干米质量2%～6%的麦曲及0.2%的酵母菌一同拌入米中，搭窝后，在其表面撒入2%～6%糖渍桂花[8，13，18]。

前发酵：糖化24 h后进行翻拌，72 h后加入50%干米质量的冷却水，发酵结束的前24 h加入40%干米质量的冷却水，开始密封产醇，12 h后再加入40%干米质量的冷却水，共计加入130%干米质量的冷却水[8]，然后进行过滤。

后发酵：撒入少量2%糖渍桂花，以增加酒中桂花的色、香、味，然后转入18 ℃条件下发酵72 h[15]。

压榨：用四层纱布过滤出酒体，装入灭菌玻璃罐中。

澄清：将盛有酒的玻璃罐密封保存，并置于阴凉干燥处放置24 h。

煎酒：将盛有酒的玻璃罐用保鲜膜密封好，放入水浴锅中加热至90 ℃，并保温20 min，即得桂花酒成品。

1.3.2 桂花酒发酵工艺优化单因素试验

以干米500 g为基准，固定酵母添加量0.2%，以感官评价和酒精度为评价指标，在麦曲添加量为0.4%，发酵温度25 ℃，发酵时间192 h条件下考察糖渍桂花添加量（2%、3%、4%、5%、6%）对桂花酒品质的影响；在糖渍桂花添加量4%，麦曲添加量0.4%，发酵时间192 h条件下考察发酵温度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）对桂花酒品质的影响；在糖渍桂花添加量4%，麦曲添加量0.4%，发酵温度25 ℃，探究发酵时间（144 h、168 h、192 h、216 h、240 h）对桂花酒品质的影响；在糖渍桂花添加量为4%，发酵温度25 ℃，发酵时间192 h，探究麦曲添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）对桂花酒品质影响。

1.3.3 桂花酒发酵工艺优化响应面试验设计

在单因素试验的基础上，使用Box-Behnken中心原理设计试验，以糖渍桂花添加量（A）、麦曲添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为4个因素，桂花酒酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，设计4因素3水平响应面试验考察各因素交互作用对桂花酒酒精度和感官评分的影响，响应面试验因素与水平见表1。

表1 桂花酒发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of Osmanthus fragrans wine

1.3.4 测定方法

pH值：pH计测定；还原糖：按照GB/T 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》中直接滴定法测定[19]；酒精度：按照GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中酒精计法测定[20]；总酸：按照GB 12456—2021《食品中总酸的测定》中酸碱指示剂滴定法[21]。

感官评定：邀请10位具有食品专业背景人员，参照GB/T 27588—2011《露酒》的标准对发酵桂花酒进行感官评分（总分100分），取10人的平均分[22]，感官评分标准见表2。

表2 桂花酒的感官评分标准Table 2 Sensory score criteria of Osmanthus fragrans wine

续表

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌干预对浸米时间的影响

浸米是黄酒制作的前端工艺，将此程序应用于桂花酒中，加快了大米的酸化过程，使大米膨胀，蒸煮缩短了工艺时间，而且降低桂花酒中的生物胺含量，提高饮后舒适感[17]。在浸泡大米的过程中，添加植物乳杆菌，其菌种快速繁殖以达到生酸，在浆水pH降至4.2左右，即可停止发酵[18]。由图1可知，在18 ℃条件下，当浸米时间60 h时浆水pH值接近4.2。因此，确定浸米的最佳时间是60 h。

图1 植物乳杆菌干预对浸米时间的影响Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum intervention on rice soaking time

2.2 桂花酒发酵工艺优化单因素试验结果

2.2.1 糖渍桂花添加量对桂花酒品质的影响

由图2可知，桂花酒酒精度、感官评分随糖渍桂花添加量的增加呈先升高后降低的趋势，糖渍桂花添加量为4%时桂花酒酒精度最高，为13.8% vol，此时感官评分为73.1分；糖渍桂花添加量为5%时桂花酒感官评分最高，为75.1分，此时酒精度为12.9% vol。当糖渍桂花添加量＜4%时，可发酵糖量减少，桂花酒的酒精度和感官评分均较低；当添加量＞4%时，可发酵糖量较多，酵母菌营养丰富迅速生长同时也快速衰亡[23]，致使酒精度和感官评分较低。因此，确定糖渍桂花添加量4%为最佳添加量。

2.2.2 麦曲添加量对桂花酒品质的影响

由图3可知，桂花酒酒精度和感官评分随着麦曲添加量的增加呈先升高后又略降低的趋势。在麦曲添加量为0.4%时桂花酒感官评分、酒精度均最高，分别为74.9分、13.7% vol。当麦曲添加量＜0.4%时，麦曲添加较少易被杂菌污染而发生变质，当添加量＞0.4%时，麦曲中的根霉菌快速生长而发生衰亡，使酒的苦味较明显[24]。因此，确定麦曲添加量0.4%为最佳添加量。

图3 麦曲添加量对桂花酒品质的影响Fig.3 Effects of wheat malt addition on the quality of Osmanthus fragrans wine

2.2.3 发酵温度对桂花酒品质的影响

由图4可知，桂花酒酒精度和感官评分随着发酵温度的升高呈先升高后又略降低的趋势。在发酵温度为30 ℃时桂花酒感官评分、酒精度均最高，分别为77.5分、14.8% vol。当发酵温度低于30 ℃时，发酵进行缓慢，且易被杂菌污染、滋味不协调；当发酵温度高于30 ℃时，高温致使麦曲（中高温曲）中的根霉菌和毛霉菌易成为优势菌，要及时进行搅拌、散温，否则会发酵失败[25]。因此，确定发酵温度30 ℃为最佳发酵温度。

图4 发酵温度对桂花酒品质的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of O.fragrans wine

2.2.4 发酵时间对桂花酒品质的影响

由图5可知，桂花酒酒精度和感官评分随着发酵时间的延长呈先升高后又略降低的趋势。在发酵时间为192 h时桂花酒感官评分、酒精度均最高，分别为76.4分、14.7% vol，当发酵时间＜192 h时，发酵时间过短，发酵不充分、酒香不明显、颜色浅黄浑浊暗淡；当发酵时间＞192 h后，发酵时间过长，酒精开始部分转化为其他醇类、酯类、有机酸等，使酒精度降低[26]，影响口感。因此，确定发酵时间192 h为最佳发酵时间。

图5 发酵时间对桂花酒品质的影响Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of Osmanthus fragrans wine

2.3 桂花酒发酵条件优化响应面试验结果与分析

由表3、表4可知，Y2模型中各因素交互作用均不显著，因此只对酒精度（Y1）进行分析。4个因素经过拟合后得酒精度（Y1）的二次多元回归方程为：Y1=15.48+0.50A+0.29B+0.19C+0.32D+0.025AB-0.100AC+0.33AD+0.37BC-0.13BD+0.20CD-0.69A2-0.38B2-0.65C2-0.84D2。由表5可知，Y1的回归方程模型显著（P＜0.000 1），失拟项P=0.076 6＞0.05不显著，表示模型与试验结果拟合度较好；决定系数R2=0.993 2，调整决定系数R2Adj=0.9863，表明酒精度的实际值与预测值之间的拟合度较高[27-28]。4个因素对酒精度的影响顺序：糖渍桂花添加量＞发酵时间＞麦曲添加量＞发酵温度。从分析中还可以看出，一次项A、B、C、D，交互项AD、BC、CD，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AC和BD对结果影响显著（P＜0.05）。

表3 桂花酒发酵条件优化响应面试验结果与分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation conditions optimization of Osmanthus fragrans wine

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression mode

2.4 各因素交互作用的响应面分析

使用Design-Expert 8.0.6软件处理数据，得出糖渍桂花添加量、麦曲添加量、发酵温度及发酵时间交互作用对桂花酒酒精度影响的响应曲面和等高线，结果如图6所示。由图6可知，等高线呈椭圆形，说明糖渍桂花添加量和发酵温度、糖渍桂花添加量和发酵时间、麦曲添加量和发酵温度、麦曲添加量和发酵时间、发酵温度和发酵时间存在交互作用，与表4方差分析结果一致。

由图6可知，随着A（糖渍桂花添加量）和C（发酵温度）的增加酒精度呈现先增后减的趋势，A对应的曲面坡度相较于C的陡峭，即A对酒精度的影响程度大于C，等高线呈椭圆形，表示A和C交互作用显著；随着A（糖渍桂花添加量）和D（发酵时间）的增加酒精度呈现先增后减的趋势，A对应的曲面坡度相较于D的陡峭，即A对酒精度的影响程度大于D，等高线呈椭圆形，表示糖渍A和D交互作用极显著（P＜0.01）；随着B（麦曲添加量）和C（发酵温度）的增加酒精度呈现先增后减的趋势，C对应的曲面坡度相较于B的陡峭，即C对酒精度的影响程度大于B，等高线呈椭圆形，表示B和C交互作用极显著（P＜0.01）；随着B（麦曲添加量）和D（发酵时间）的增加酒精度呈现先增后减的趋势，D对应的曲面坡度相较于B的陡峭，即D对酒精度的影响程度大于B，等高线呈椭圆形，表示B和D交互作用显著（P＜0.05）；随着C（发酵温度）和D（发酵时间）的增加酒精度呈现先增后减的趋势，D对应的曲面坡度相较于C的陡峭，即D对酒精度的影响程度大于C，等高线呈椭圆形，表示C和D交互作用极显著（P＜0.01）。

图6 各因素交互作用对桂花酒酒精度影响的响应曲面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on alcohol content of Osmanthus fragrans wine

最终得到最优工艺参数：生酸过程为植物乳杆菌添加量0.1%，18 ℃条件下发酵60 h；发酵过程为糖渍桂花添加量5%，麦曲添加量0.3%，固定酵母添加量0.2%，发酵温度30 ℃，发酵时间192 h。

2.5 模型验证

为了验证模型具有可行性，用得到的最佳工艺参数进行验证试验，3次平行试验得到桂花酒酒精度为14.61% vol，感官评分达到81.9分。酒精度与预测值（14.50% vol）相对误差为0.007 8，模型不显著（P＞0.05），模型验证成功，桂花酒品质工艺优化是可行的，得到的工艺参数具有实际应用价值。最后测得成品桂花酒糖度（以葡萄糖计）为23 g/L，酸度（以乳酸计）为3.6 g/L，口感清爽，酒体金黄透亮。

3 结论

本试验得出的桂花酒最佳工艺，即选择自制优质干桂花，先制作成糖渍桂花，添加0.1%植物乳杆菌，大米进行酸化，添加0.2%酵母、5%糖渍桂花、0.3%麦曲，在30 ℃发酵192 h，然后过滤，即可得到感官评分81.9分，酒精度为14.61% vol，糖度为23 g/L（以葡萄糖计），酸度3.6 g/L（以乳酸计）的桂花酒。桂花酒有着浓郁的桂花香气，诸香和谐纯正，口感清爽，酒体呈金黄透亮。

传统黄酒生产工艺，在发酵前期加入了新鲜桂花，使得酒精度介于12% vol～13% vol，糖度（以葡萄糖计）45～50 g/L，总酸（以乳酸计）4.5～6.5 g/L。本试验的结果中酒精度较高，糖度较低，酸度较低，口感清爽，酒液清亮，如何将酒精度降低至12% vol～13% vol、提升残糖还有待进一步研究，在积极改善桂花酒的口感的同时且不失营养功效，在降低成本的同时提高附加值，为桂花酒的研究提供了一定的基础，且有益于本地经济发展。